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猪流行性腹泻病毒N蛋白单抗的制备及其模拟表位鉴定

作　者: 吴丹
导　师: 任晓峰
学　校: 东北农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 猪流行性腹泻病毒单克隆抗体噬菌体展示技术模拟表位
分类号: S858.28
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea, PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)引起的仔猪高致死率的高度接触性肠道传染病。目前,虽然商品化PEDV疫苗已普遍使用,但该病在我国仍有流行,并引起严重的经济损失。本病的流行病学特征和临床症状与猪传染性胃肠炎无明显差别,在鉴别诊断与疫苗的应用方面存在很大的困难,因此研制一种新型的有效的用于防治PEDV的疫苗以及鉴别诊断方法具有实践意义。抗原表位的研究在揭示抗原分子的结构和功能、抗原抗体反应机制方面具有重要意义,抗原表位的研究还可用于多肽疫苗和新型药物的研发。噬菌体展示技术是一种廉价且快速的方法能够鉴定与抗体有特殊反应的抗原表位。20世纪80年代末,Stephen等研制了一种噬菌体载体系统。近年来,利用噬菌体载体系统制备的噬菌体随机肽库逐渐应用于蛋白质的抗原表位分析中。本研究通过RT-PCR克隆了PEDV N蛋白的基因,构建重组质粒pET-30a-N。将重组质粒pET-30a-N转化到宿主表达菌Rosseta中,用终浓度为1mmol/L的IPTG对宿主表达菌诱导表达,经SDS-PAGE分析表达产物。结果表明N基因在原核表达系统pET-30a中获得表达,表达的重组蛋白大小约为60KD。然后以PEDV-N蛋白为免疫原免疫小鼠,制备了4株抗PEDV的单克隆抗体。利用噬菌体随机12肽库对其中一株单抗3F8进行4轮淘选,获得了12个阳性噬菌体克隆,测序结果显示：11个噬菌体展示一致序列TPxxWxxYxxxxGP;与PEDV多株N蛋白氨基酸序列70-82氨基酸QPSNWHFYYLGTGP相似度很高；1个噬菌体展示序列DPGHRLLAWDRL,展示序列为HxxLxWDxx(x代表随机氨基酸残基),与PEDV多株N蛋白氨基酸序列中414HANLEWD422有一定的同源性。噬菌体ELISA和抗原竞争抑制试验证实筛选到的噬菌体展示多肽的空间构象与天然抗原表位相同或相似,可用于检测PEDV抗体,也可用于表位疫苗的研究,将对猪流行性腹泻病毒诊断及表位疫苗研究具有一定的参考价值。

全文目录

摘要  8-9
Abstract  9-11
1 前言  11-18
  1.1 PED的概述  11-13
    1.1.1 基因组结构  11
    1.1.2 结构蛋白及其功能  11-12
    1.1.3 分子流行病学  12-13
    1.1.4 诊断与防制  13
  1.2 PEDV抗原表位研究进展  13
  1.3 抗原表位研究方法  13-15
    1.3.1 B细胞抗原表位研究方法  14
    1.3.2 T细胞抗原表位研究方法  14-15
  1.4 噬菌体表面展示技术的应用  15-17
    1.4.1 蛋白相互之间作用的研究  15
    1.4.2 特异性酶类和抑制剂的筛选  15-16
    1.4.3 诊断与疫苗的开发  16
    1.4.4 抗原决定簇与模拟表位的筛选  16-17
    1.4.5 受体的筛选  17
  1.5 研究目的和意义  17-18
2 材料与方法  18-30
  2.1 材料  18-22
    2.1.1 菌株  18
    2.1.2 实验动物和细胞  18
    2.1.3 主要试剂  18-19
    2.1.4 主要溶液的配制  19-21
    2.1.5 主要仪器  21-22
  2.2 实验方法  22-30
    2.2.1 重组蛋白的表达与纯化  22-23
    2.2.2 动物的免疫  23
    2.2.3 单克隆抗体的制备  23-25
    2.2.4 单克隆抗体及杂交瘤细胞的特性鉴定  25-27
    2.2.5 单抗(3F8、1D8)的提纯  27
    2.2.6 利用噬菌体展示技术筛选单克隆抗体3F8识别的模拟表位  27-30
3 结果  30-44
  3.1 重组蛋白制备与纯化  30-31
    3.1.1 重组菌的诱导表达与SDS-PAGE分析  30
    3.1.2 重组蛋白的SDS-PAGE分析  30-31
    3.1.3 纯化的重组蛋白浓度的测定  31
  3.2 细胞融合与筛选  31-33
    3.2.1 间接ELISA法测定3免后小鼠血清抗体效价  31-32
    3.2.2 最佳抗原及抗体工作浓度的确定  32
    3.2.3 细胞融合率的计算  32
    3.2.4 阳性杂交瘤细胞的筛选和建立  32-33
    3.2.5 杂交瘤细胞分泌抗体稳定性的鉴定  33
  3.3 单克隆抗体的鉴定  33-37
    3.3.1 杂交瘤细胞培养上清液效价的测定  33-35
    3.3.2 腹水单抗效价测定  35-36
    3.3.3 抗体亚类鉴定结果  36
    3.3.4 IFA鉴定  36-37
    3.3.5 Western blot鉴定  37
  3.4 单抗的纯化  37-39
    3.4.1 辛酸-硫酸铵法提纯腹水  37
    3.4.2 纯化前后腹水抗体效价的测定  37-39
  3.5 利用噬菌体展示技术筛选单克隆抗体3F8识别模拟表位  39-44
    3.5.1 噬菌体随机12肽库的筛选及富集  39-40
    3.5.2 噬菌体结合克隆的ELISA初步鉴定结果  40
    3.5.3 噬菌体结合克隆的核苷酸序列测定结果  40-42
    3.5.4 PEDV N蛋白抗原竞争抑制试验  42-44
4 讨论  44-46
5 结论  46-47
致谢  47-48
参考文献  48-52
攻读硕士期间发表的学术论文  52

猪流行性腹泻病毒N蛋白单抗的制备及其模拟表位鉴定

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