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辐照致弱日本血吸虫免疫生物学功能的初步研究

作　者: 李运燕
导　师: 冯新港
学　校: 上海师范大学
专　业: 动物学
关键词: 日本血吸虫辐照致弱尾蚴抗原提呈细胞钙网织蛋白免疫原性
分类号: S855.9
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

血吸虫病是一种严重危害人畜健康的寄生虫病。目前血吸虫病治疗主要依赖吡喹酮药物治疗，然而抗药性是必须面对的一个重大问题，因此高效安全的抗血吸虫疫苗的应用，是实现长期有效地控制血吸虫病的重要前提。随着分子生物学技术的发展与应用，血吸虫病疫苗候选抗原的研究虽有了重大进展,但深入研究发现均不能获得较高(>40%)的免疫保护力。长期的研究发现：辐照致弱(RA)血吸虫尾蚴或童虫免疫可在多种动物模型中诱导较高的抗感染效果，但其作为疫苗应用存在材料来源困难、安全性等问题；因此，如果能结合分子疫苗与辐照疫苗的优点，可能会成为成功研发高效安全的抗血吸虫疫苗的突破口。研究显示：正常血吸虫尾蚴感染宿主后，依次经过皮肤童虫、肺期童虫、肝门期童虫、成虫和虫卵等阶段。宿主免疫应答至少经历3个变化时相，感染后最初3-5周，宿主暴露在移行中的未成熟童虫的刺激中，呈现Th1优势应答；至第5-6周，成虫开始产卵，Th1应答降低，呈现Th2优势应答；随后感染进入慢性期，Th2应答受到明显调节。而辐照尾蚴免疫宿主后，虫体只能移行至肺，无成虫阶段，不能产卵，宿主呈现Th1应答，与正常早期童虫诱导的应答相类似。宿主对RA血吸虫免疫的应答模式可能与虫体特征性抗原表达及宿主特征性的先天和获得性免疫应答相关。但是，这一应答过程的启动、维持和调节的细胞与分子机制仍不十分清楚，特别是对于参与这一过程的虫源性组分的特性和相关的免疫生物学功能了解得更少。推测RA虫体来源的细胞和应激分子在诱导宿主产生高保护性免疫应答中起重要作用。因此本研究以体外转化培养的血吸虫童虫为材料，观察和比较辐照虫体与正常虫体形态变化及其刺激小鼠抗原提呈细胞的功能特征；研究日本血吸虫应激分子钙网织蛋白(SjCRT)在辐照致弱(RA)血吸虫尾蚴来源虫体细胞上的表达图式和免疫原性功能，为高效安全的抗血吸虫疫苗的研制提供基础。首先，观察了辐照致弱血吸虫形态变化特征。采用适宜的紫外辐照剂量致弱日本血吸虫尾蚴。体外培养辐照尾蚴转化的童虫，光学显微镜观察4天、7天、10天和14天四个期别虫体形态变化，设正常虫体对照组。结果发现不同期别正常组虫体形态呈现正常发育特征，且虫体蠕动频率与幅度变化差异不显著。而辐照组中，4天时，虫体大小与正常组虫体相比无明显差异，虫体颜色比正常组偏暗，颜色不均一；7到10天时可以观察到虫体的体表形态发生变化，出现畸形现象，其体表凹凸不平，体表上的节段性环槽逐渐消失，体表体被开始出现不同程度的损伤，有的体被开始与体部剥脱，形成空泡，虫体蠕动频率减弱，幅度减小，虫体体部伸展性变差。14天时辐照组虫体体腔浆液化，体被崩解，虫体蠕动基本消失，在光镜最高倍数下观察到小幅度的蠕动。说明辐照后的虫体呈现出明显的凋亡和坏死的形态学变化。其次，比较了辐照和正常血吸虫活化小鼠骨髓源树突细胞(BMDC)的功能。常规法取小鼠胫骨和股骨骨髓细胞，分离培养BMDC，然后用体外培养的4天、7天、10天和14天的正常和辐照虫体分别与BMDC共培养，流式细胞术测定BMDC细胞表面MHCⅡ类分子及共刺激分子CD40、CD80和CD86表达。结果表明：4天时，正常血吸虫组与辐照致弱血吸虫组之间BMDC细胞表面MHCⅡ类分子和共刺激分子CD40、CD80和CD86的表达没有明显差异(P>0.05)；7天时，辐照致弱血吸虫组BMDC细胞表面MHCⅡ类分子和共刺激分子CD40、CD80和CD86的表达水平显著高于正常血吸虫组的(P<0.05)；10天时，辐照组BMDC细胞表面MHCⅡ、CD40、CD80和CD86分子的表达水平显著高于正常组的(P<0.05)；14天时，辐照组BMDC细胞表面四种分子的表达高于正常组，MHCⅡ类分子和共刺激分子CD40和CD80差异显著(P<0.05)，CD86的表达差异不显著(P>0.05)。提示辐照虫体较之正常虫体具有更强的刺激小鼠DC表型成熟的能力。然后，观察了SjCRT在辐照致弱(RA)血吸虫虫体细胞上的表达分布情况及刺激BMDC表面共刺激分子CD80的表达情况。胰酶冷消化体外培养的不同期别的日本血吸虫童虫，获得血吸虫虫体细胞。显微镜观察发现虫体细胞较小，种类较多，大部分细胞呈高核质比率。流式细胞术测定结合免疫荧光定位观察结果显示：辐照组SjCRT在7天虫体细胞中表达水平显著高于正常组(P<0.05)；且在辐照组中SjCRT分布于近细胞膜的内侧，而正常组中主要散布于胞质内。流式细胞术测定SjCRT在4天、7天、10天和14天虫体细胞外表面上的表达结果显示，4天、7天和10天时辐照组虫体细胞膜外表面SjCRT的表达量都明显低于正常组的(P<0.05)；14天时辐照组的略高于正常组的，但无显著差异(P>0.05)。参照本实验室提供的方法，用昆虫/杆状病毒表达系统，获得了真核表达的重组SjCRT蛋白(rSjCRT)，常规法分离获得BMDC，rSjCRT与BMDC共培养，流式细胞术测定BMDC表面的共刺激分子CD80的表达水平。结果表明：与空白对照组相比，与rSjCRT蛋白共培养的DC组的细胞表面CD80分子的表达量显著高于空白对照组的(P﹤0.05)。提示SjCRT在辐照早期虫体中主要分布于胞内临近细胞膜内侧区域；SjCRT可刺激BMDC的表型成熟。总之，本研究发现RA虫体呈现出与凋亡和坏死相关的表型变化，RA虫体本身及重组的血吸虫应急分子rSjCRT具有刺激小鼠BMDC表型成熟的功能，为进一步研究RA虫体诱导的保护性免疫的细胞与分子基础提供了依据。

全文目录

摘要  6-9
Abstract  9-15
英文缩略表  15-16
第一章绪论  16-24
  1.1 血吸虫分类及生活史  16
  1.2 血吸虫感染及宿主免疫应答  16-20
    1.2.1 血吸虫免疫应答及宿主免疫应答结果  17-18
    1.2.2 血吸虫诱导的宿主免疫应答的调节与抗原提呈细胞  18-20
  1.3 辐照致弱血吸虫疫苗及其诱导免疫保护作用机制  20-22
    1.3.1 RA血吸虫疫苗免疫的效应及其基本生物学特征  20-22
    1.3.2 RA血吸虫疫苗可能的免疫原性功能特征  22
  1.4 钙网织蛋白的免疫生物学功能  22-24
第二章紫外辐照致弱血吸虫幼虫的体外培养及其形态学观察  24-29
  2.1 实验材料  24-25
    2.1.1 实验动物：  24
    2.1.2 试剂：  24-25
    2.1.3 仪器与耗材  25
  2.2 实验方法  25-26
    2.2.1 尾蚴体外收集  25
    2.2.2 辐照致弱日本血吸虫尾蚴  25-26
  2.3 结果  26-28
    2.3.1 辐照致弱日本血吸虫尾蚴体外培养4天、7天、10天和14天各期别的形态变化  26-28
  2.4 讨论  28-29
第三章辐照致弱血吸虫童虫活化DC的功能分析  29-37
  3.1 实验材料  29-30
    3.1.1 实验动物  29
    3.1.2 试剂  29-30
    3.1.3 仪器与耗材  30
  3.2 实验方法  30-32
    3.2.1 制备DC细胞  30
    3.2.2 磁珠分选BMDC  30-31
    3.2.3 流式细胞术检测细胞因子  31-32
  3.3 实验结果  32-35
    3.3.1 辐照致弱童虫上调BMDC表面共刺激分子  32-35
  3.4 讨论  35-37
第四章 SjCRT免疫生物学功能初步研究  37-50
  4.1 实验材料  37-38
    4.1.1 实验动物和细胞  37
    4.1.2 实验试剂  37-38
    4.1.3 实验耗材和仪器  38
  4.2 实验方法  38-41
    4.2.1 日本血吸虫钙网织蛋白(SjCRT)的真核表达及Western blot分析  38-39
    4.2.2 体外培养的血吸虫童虫虫体细胞消化  39
    4.2.3 SjCRT在7天血吸虫虫体细胞上的表达定位  39-40
      4.2.3.1 多聚赖氨酸包被玻片  39
      4.2.3.2 SjCRT在7天血吸虫虫体细胞上的免疫荧光定位  39-40
    4.2.4 流式细胞术测定CRT在7天血吸虫虫体细胞上表达  40
    4.2.5 流式细胞术检测不同期别日本血吸虫虫体细胞膜外SjCRT表达  40
    4.2.6 流式细胞术测定CRT刺激DC成熟检测  40-41
  4.3 结果  41-47
    4.3.1 SjCRT蛋白真核表达  41-42
    4.3.2 SjCRT在7天辐照致弱虫体细胞上的富集表达  42-44
    4.3.3 SjCRT在4天、7天、10天和14天虫体细胞膜外的表达  44-47
    4.3.4 SjCRT刺激BMDC上调表达CD80  47
  4.4 讨论  47-50
第五章全文总结  50-52
致谢  52-53
参考文献  53-57
硕士期间取得的研究成果  57

辐照致弱日本血吸虫免疫生物学功能的初步研究

内容摘要

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