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Real-time PCR检测水体日本血吸虫尾蚴和小鼠感染早期检测的研究

作　者: 王本敬
导　师: 诸葛洪祥
学　校: 苏州大学
专　业: 病原生物学
关键词: 日本血吸虫多重复序列实时定量PCR 早期诊断
分类号: R532.21
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

目的:(1)比较日本血吸虫DNA重复序列pSjrh1.0(U92488.1)、18S小亚基单位核糖体核酸基因(18SrRNA)序列(AY157226.1)和SjR2的G55A克隆(AF412221.1)在基因组中的丰度,初步确定SYBR Green I荧光实时定量PCR(RQ-PCR)方法检测日本血吸虫的较适宜靶基因和反应条件。(2)建立SYBR Green I荧光RQ-PCR检测水体中日本血吸虫DNA的方法,作DNA浓度对数和初始循环数(Ct值)的标准曲线,评价方法的可靠性。(3)定量检测水体中日本血吸虫尾蚴,作尾蚴数的对数和Ct值的标准曲线,评估水体中日本血吸虫尾蚴的数量。(4)比较RQ-PCR法与ELISA法的早期检测日本血吸虫尾蚴感染的效果,选择较好的早期诊断方法。方法:(1)设计常规PCR引物,建立温度梯度PCR,并对扩增产物进行测序,确定保守序列。(2)根据测序结果,针对三个重复序列的保守序列设计RQ-PCR引物,通过建立温度梯度和浓度梯度RQ-PCR,确定丰度较高的靶序列。(3)在较适宜的反应条件下,作日本血吸虫DNA浓度对数和Ct值的标准曲线,得到相关系数。(4)绘制日本血吸虫尾蚴数量和Ct值的标准曲线,得到相关系数。(5)分别用ROSE法和全基因组提取试剂盒提取5、10和20条尾蚴感染第2、4、6、8和15天的小鼠血清中DNA,用RQ-PCR进行检测;用ELISA法检测第1、2、3和4w感染尾蚴的小鼠血清中抗日本血吸虫虫体抗原的IgG,确定可检测到小鼠感染日本血吸虫尾蚴的最早时间。结果:(1)普通PCR产物进行琼脂糖凝胶电脉,表明:pSjrh1.0和18SrRNA在退火温度57.4℃下,引物浓度为20pmol时,反应体系较佳;G55A在退火温度58.8℃下,引物浓度为20pmol时,反应体系较佳。对其测序结果表明:pSjrh1.0的产物与NCBI发表序列比较,只有一个碱基不同;18SrRNA的产物与NCBI发表序列比较,完全相同;而G55A的变异性较大,与NCBI发表序列比较,有20多个碱基不同。(2)设计荧光RQ-PCR引物,扩增片段约为160bp,温度梯度PCRjrh1.0在基因组中的丰度最高。(3)以pSjrh1.0为靶序列建立RQ-PCR可检测到本血吸虫成虫基因组DNA的浓度为2fg,用配套软件绘制2fg~2×108fg的标准曲,相关系数为0.9977,而对DNA为0.2fg的浓度下和阴性对照双蒸水的检测结为阴性。重复实验表明,其变异系数小于2%,可靠性很好。(4)分别提取1、5、、20和80条日本血吸虫尾蚴的DNA,建立尾蚴条数的对数和Ct值的标准曲线,相关系数为0.9186,相关性良好。重复实验和标准曲线的变异系数都小于3%,靠性良好。(5)对ROSE法和试剂盒法提取感染小鼠血清中DNA的检测结果表:ROSE法较试剂盒法的检测阳性率更高。感染10条尾蚴的小鼠第2w的检测果为阳性,而用ELISA法检测第4w仍为阴性。结论:RQ-PCR较普通PCR方法具有更高的检测精度,特异性高,可靠性好; pSjrh1.0为靶基因建立的荧光PCR方法可检测到2fg的日本血吸虫DNA,DNA度的对数和Ct值具有良好的线性关系,尾蚴数的对数和Ct值具有良好的线性关,且可靠性良好,Ct值能够准确反应尾蚴的数量。本方法建立的RQ-PCR具有好的早期诊断效果和临床应用价值。

全文目录

中文摘要  4-6
Abstract  6-10
引言  10-14
第一部分日本血吸虫基因组内三种多重复序列丰度的比较  14-27
  1 材料和方法  14-16
  2 实验结果  16-24
  3 讨论  24-27
第二部分 SBRY Green I 实时定量PCR 定量检测水体中尾蚴方法的建立及效果评价  27-39
  1 材料和方法  27-30
  2 结果  30-37
  3 讨论  37-39
第三部分以小鼠为模型的日本血吸虫病的检测  39-46
  1 实验材料和方法  39-41
  2 结果  41-44
  3 讨论  44-46
结论  46-48
参考文献  48-52
综述：实时定量PCR 的特点及其研究寄生虫方面的应用  52-64
  参考文献  60-64
攻读学位期间发表的论文  64-65
缩略词表  65-66
致谢  66-67

Real-time PCR检测水体日本血吸虫尾蚴和小鼠感染早期检测的研究

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