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日本血吸虫尼克酰胺磷酸核糖转移酶及白介素-16的克隆、表达与初步鉴定

作　者: 葛军
导　师: 陈红根
学　校: 南昌大学
专　业: 动物学
关键词: 日本血吸虫 尼克酰胺磷酸核糖转移酶 白介素-16 疫苗
分类号: R392
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


血吸虫病是一种严重危害人体健康和阻碍社会经济发展的人畜共患寄生虫病。控制日本血吸虫病流行仍然是我国亟待解决的公共卫生问题之一。由于采用反复大规模吡喹酮化疗并不能阻止血吸虫重复感染,且有可能产生抗药性等问题,因而,疫苗作为长期有效的血吸虫病防治可能措施而倍受关注,有关的研制努力近年十分活跃。随着日本血吸虫基因组草图的完成,血吸虫疫苗研究进入了后基因组时代,已获得了虫体不同发育阶段及性别相关的基因表达和蛋白表达谱的大量数据。这些数据有助于全面认识和理解血吸虫的生长发育、宿主与血吸虫的相互作用、免疫逃避以及潜在疫苗候选抗原。迄今,一些有希望的日本血吸虫疫苗候选抗原已经获得了克隆和表达。但动物实验结果表明,这些候选抗原的保护效果并不理想,减虫率一般在20%-40%,减卵率在30%-70%,保护率较低,尚不能满足血吸虫病实际防治的需要。因此有必要进一步发掘新的疫苗候选抗原分子。尼克酰胺磷酸核糖转移酶(NAMPT),又称为前B细胞增强因子(PBEF),是尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)补救合成途径的限速酶,催化底物尼克酰胺转变为中间产物尼克酰胺腺嘌呤单核苷酸(NMN),后者在尼克酰胺腺嘌呤单核苷酸腺苷酰基转移酶的作用下生成终产物NAD。NAD是细胞氧化还原反应经典辅酶,具有广泛的生物学功能。另外,NAMPT(?)能够调节细胞生长、增值和分化,促进细胞对葡萄糖的摄取,具有类胰岛素功能。白介素16(IL-16)因可以诱导人和大鼠CD4+T细胞游走应答,又称为淋巴细胞趋化因子(lymphocyte chemoattractant factor, LCF),IL-16前体无生物学活性,在胞浆中由Caspase酶加工为分泌性的IL-16单体,并以非共价方式结合为四聚体结构,从而具有了刺激细胞增殖、生长、分化以及抑制HIV复制的生物学活性。日本血吸虫尼克酰胺磷酸核糖转移酶(SjNAMPT)基因和白介素16(SjIL-16)基因是日本血吸虫基因组研究中发现的2种新基因。迄今为止,国内外对SjNAMPT及SjIL-16的相关研究未见报道。本研究以寻找新的疫苗候选抗原为目的,根据SjNAMPT基因和SjIL-16基因序列,采用生物信息学方法预测其编码蛋白的基本结构和功能,并设计引物,以日本血吸虫成虫cDNA为模板,PCR扩增目的基因,将其克隆到原核表达载体pET8a中,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达,表达产物通过镍柱亲和层析纯化,通过免疫印迹技术检测纯化蛋白的免疫原性,初步分析了SjNAMPT基因和SjIL-16基因在日本血吸虫不同发育阶段的转录水平,并通过ELISA和免疫保护性实验来评价SjNAMPT和SjIL-16蛋白的诊断效能和免疫保护效果。本研究在原核表达系统中成功克隆表达了SjNAMPT和SjIL-16基因,获得了以不可溶包涵体形式表达的纯化蛋白。转录特异性研究表明：SjNAMPT基因和SjIL-16基因都是虫期特异性表达基因。SjNAMPT基因在虫卵和雌虫中不转录,在毛蚴、胞蚴、尾蚴、童虫、合抱成虫,雄虫中转录水平较高,其在雌虫,雄虫阶段转录差异表明该基因可能是性别差异基因。SjIL-16基因在血吸虫发育初期阶段不转录或低转录,而在进入终宿主后的童虫,雄虫和合抱成虫阶段中高水平转录,表明该基因的转录可能受到日本血吸虫发育机制的调节,并有可能与终宿主体内日本血吸虫的发育、分化或宿主依赖性有关。此外,SjIL-16在雌虫个体和雄虫个体的转录差异说明该基因也可能是性别差异基因。免疫原性分析显示：SjNAMPT(?)(?)SjIL-16蛋白都具有一定的免疫原性,可作为疫苗的候选抗原。采用酶联免疫吸附试验法(ELISA)检测血吸虫病人血清中的抗体,SjNAMPT(?)(?)SjIL-16蛋白的敏感性分别为56.0%和60.0%,特异性分别为94.4%和95.4%。SjNAMPT和SjIL-16蛋白免疫C57/BL6雌性小鼠,减虫率分别为19.5%和20.7%,粪减卵率分别为24.0%和18.5%,与佐剂组相比,差异具有显著性,说明SjNAMPT和SjIL-16蛋白作为候选疫苗分子可诱导小鼠产生部分保护效果。

全文目录


摘要  3-5
Abstract  5-12
第一部分 绪论  12-21
  1 血吸虫生物学基础  12-14
    1.1 血吸虫的分类和种类  12
    1.2 血吸虫的分布  12-13
    1.3 血吸虫的生活史  13-14
    1.4 我国血吸虫病流行现状  14
  2 日本血吸虫病疫苗的研究进展  14-16
    2.1 血吸虫疫苗研制的可行性  15
    2.2 血吸虫病疫苗研制历程  15-16
  3 几种重要的日本血吸虫候选抗原及其免疫保护效力  16-18
  4 本课题研究背景、内容和意义  18-19
    4.1 研究背景  18-19
    4.2 研究目的  19
    4.3 研究内容  19
    4.4 研究意义  19
  5 技术路线  19-21
第二部分 SjNAMPT的克隆、表达与初步鉴定  21-61
  第1章 SjNAMPT的生物信息学分析  21-33
    1.1 材料和方法  21-23
      1.1.1 SjNAMPT cDNA序列及开放阅读框(ORF)分析  21-22
      1.1.2 蛋白质理化性质分析  22
      1.1.3 蛋白质功能区域分析  22
      1.1.4 模序(Motif)搜索  22
      1.1.5 蛋白空间结构预测  22
      1.1.6 抗原决定簇预测  22
      1.1.7 同源序列比对  22
      1.1.8 分子系统发育分析  22-23
    1.2 结果  23-33
      1.2.1 SjNAMPT基因序列、ORF序列及编码蛋白序列  23
      1.2.2 SjNAMPT蛋白质基本理化性质分析  23-25
      1.2.3 SjNAMPT蛋白质功能分析  25-28
      1.2.4 SjNAMPT蛋白结构预测  28-29
      1.2.5 SjNAMPT蛋白同源序列比对及分子系统发育分析  29-31
      1.2.6 抗原决定簇预测  31-32
      1.2.7 亚细胞定位预测  32-33
  第2章 SjNAMPT基因的克隆表达  33-43
    2.1 材料、仪器和试剂  33-36
      2.1.1 材料  33
      2.1.2 仪器  33-34
      2.1.3 试剂  34
      2.1.4 部分试剂配方  34-36
    2.2 方法  36-40
      2.2.1 SjNAMPT基因编码序列的克隆  36-39
      2.2.2 SjNAMPT基因的表达  39-40
    2.3 结果  40-43
      2.3.1 SjNAMPT基因的PCR扩增  40
      2.3.2 pET28a质粒的抽提  40-41
      2.3.3 重组质粒的测序  41
      2.3.4 重组质粒的表达  41-43
  第3章 SjNAMPT蛋白的纯化  43-47
    3.1 材料、仪器和试剂  43
    3.2 方法  43-44
      3.2.1 重组蛋白SjNAMPT的纯化  43-44
      3.2.2 蛋白浓度测定  44
    3.3 结果  44-47
  第4章 SjNAMPT基因在日本血吸虫各发育期转录特异性  47-49
    4.1 材料、仪器和试剂  47
    4.2 方法  47
    4.3 结果  47-49
  第5章 SjNAMPT重组蛋白的免疫原性分析  49-53
    5.1 材料、仪器和试剂  49
    5.2 方法  49-51
    5.3 结果  51-53
  第6章 SjNAMPT蛋白诊断日本血吸虫病价值研究  53-56
    6.1 材料、仪器和试剂  53
    6.2 方法  53-54
    6.3 结果  54-56
      6.3.1 SjNAMPT包被浓度的确定  54
      6.3.2 SjNAMPT重组蛋白的诊断效能  54-56
  第7章 SjNAMPT重组蛋白的免疫保护性实验  56-59
    7.1 材料和试剂  56
    7.2 方法  56-58
      7.2.1 实验分组  56
      7.2.2 免疫方案  56-57
      7.2.3 采血方案  57
      7.2.4 尾蚴攻击感染  57
      7.2.5 成虫、虫卵计数  57-58
    7.3 结果  58-59
  第8章 结论及讨论  59-61
第三部分 日本血吸虫白介素-16(SjIL-16)克隆、表达及鉴定  61-83
  前言  61
  第1章 SjIL-16的生物信息学分析  61-71
    1.1 材料和方法  61-62
    1.2 结果  62-71
      1.2.1 SjIL-16基因序列、ORF序列及编码蛋白序列  62
      1.2.2 SjIL-16蛋白质基本理化性质  62-64
      1.2.3 SjIL-16蛋白质结构功能域  64-68
      1.2.4 SjIL-16蛋白二级结构预测  68-69
      1.2.5 SJIL-16蛋白三级结构预测  69
      1.2.6 同源序列比对  69-70
      1.2.7 SjIL-16分子系统发育分析  70-71
  第2章 SjIL-16重组质粒的构建、表达及纯化  71-76
    2.1 材料和方法  71
      2.1.1 材料  71
      2.1.2 方法  71
    2.2 结果  71-76
      2.2.1 SjIL-16基因的PCR扩增  71-72
      2.2.2 SjIL-16的原核表达  72-73
      2.2.3 SjIL-16蛋白的纯化  73-74
      2.2.4 SjIL-16蛋白浓度测定  74-76
  第3章 SjIL-16基因在日本血吸虫各发育期的转录特异性  76-77
    3.1 材料、仪器和方法  76
    3.2 结果  76-77
  第4章 SjIL-16重组蛋白的免疫原性、诊断价值和免疫保护性研究  77-81
    4.1 材料和方法  77
    4.2 结果  77-81
      4.2.1 SjIL-16蛋白的免疫原性分析  77-78
      4.2.2 SjIL-16蛋白ELISA包被浓度的确定  78
      4.2.3 SjIL-16蛋白诊断价值研究  78-79
      4.2.4 SjIL-16蛋白动物保护性实验  79-81
  第5章 结论与讨论  81-83
参考文献  83-87
致谢  87-88
攻读学位期间的研究成果  88-89
附录 日本血吸虫尼克酞胺磷酸核糖转移酶的生物信息学分析  89-97

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 医学免疫学
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