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日本血吸虫钙网织蛋白活化抗原提呈细胞功能的分析

作　者: 李莹
导　师: 冯新港
学　校: 上海师范大学
专　业: 动物学
关键词: 日本血吸虫 钙网织蛋白 抗原提呈细胞 免疫原性
分类号: R392
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


日本血吸虫病仍然是流行于我国的人畜共患病之一，长期有效地控制病的流行有赖于高效安全疫苗的应用。因此，开发高效、安全、实用的抗血吸虫疫苗一直是血防研究中亟待解决的难题。大量研究表明：通过模拟辐照致弱血吸虫尾蚴或童虫疫苗（RAV）诱导的高保护性效应机理来研发高效而又安全的分子疫苗，可能是突破上述难题的有效策略之一。因此，探索RAV的高保护性效应机制成为研究者们关注的热点课题，其中，RAV的免疫原性的分子与细胞基础及其机制等问题尤其受到重视。以前的研究还显示：钙网织蛋白（Calreticulin，CRT）是一类进化上较为保守的分子，由保守的球状N端结构域和脯氨酸富集结构域、以及酸性的C端结构域所组成，属于Ca2+结合伴侣蛋白，最初定位于内质网，参与调节蛋白质的正确折叠、基因转录和翻译后修饰等过程。最近报道，经某些药物或紫外照射等处理的肿瘤细胞以及凋亡的细胞的CRT会移位至细胞表面，从而给巨噬细胞和树突细胞（Dendritic cells, DC）等抗原提呈细胞提供了一种“eat me”信号，最终导致这些细胞被吞噬和处理；同时，在这些细胞的其他应急分子的共同作用下，还可增强肿瘤抗原的免疫原性。提示细胞表面CRT的暴露能够引起其被DC吞噬，从而诱导更强的免疫反应。另外，Naglaa El Gengehi等人鉴定了曼氏血吸虫的CRT为辐照致弱疫苗的一种免疫显性T细胞抗原，本课题组陈雷等也发现日本血吸虫的CRT（SjCRT）含有一个杂合型的Th1细胞表位，说明血吸虫的CRT可能是血吸虫RAV中的一个重要的T细胞抗原。因此，可以推断，在RA血吸虫疫苗模型中，来源于血吸虫的一些保守的应急分子如CRT和HSP70等分子可能起到了关键作用，它们很可能通过与宿主DC作用，形成引发和驱使保护性的先天和适应性免疫应答的环境。但是，血吸虫的CRT分子是否能够活化宿主的DC诱导特征性的先天免疫反应，仍有待进一步研究。因此，本研究在克隆表达日本血吸虫CRT基础上，观察了该分子在血吸虫不同发育阶段虫体中的定位情况，并初步分析了SjCRT刺激小鼠抗原提呈细胞的功能特征，旨在为进一步阐明SjCRT在RAV中的免疫生物学功能和机制提供初步的资料。首先，应用常规分子生物学技术克隆SjCRT分子，并在原核表达系统中表达该分子，Western bloting分析了该蛋白分子的免疫原性，免疫荧光法观察SjCRT分子在不同期别虫体中的组织定位。结果克隆和表达了日本血吸虫重组蛋白(rSjCRT)；Westen Blot分析显示，该重组蛋白免疫鼠血清可以识别7d、14d、23d、32d和42d的日本血吸虫的虫体蛋白；免疫荧光检测表明在7d、10d、14d日本血吸虫童虫体表膜呈现明显的荧光信号。为避免原核表达的蛋白含有脂多糖（LPS）而影响后续实验，采用Bac-To-Bac杆状病毒真核表达系统进行SjCRT蛋白的表达；His柱纯化表达蛋白，Westen Blot分析蛋白免疫原性。结果在杆状病毒表达系统中表达了SjCRT蛋白；Westen Blot分析显示，纯化后的SjCRT蛋白能够被标签His单抗识别，也能被原核表达SjCRT蛋白的免疫鼠血清所识别，为后续活化DC功能的实验研究提供了材料。RAW264.7巨噬细胞株具有较强的抗原吞噬功能，是常用的研究先天免疫功能的细胞模型。本实验采用以原核表达后除去LPS的SjCRT蛋白作为抗原观察其活化RAW264.7细胞的功能。CCK-8法检测SjCRT蛋白刺激RAW264.7细胞的增殖情况；流式细胞术检测SjCRT蛋白刺激后RAW264.7细胞表面标志分子MHCⅡ和TLR2与TLR4等受体分子的表达情况。结果表明，SjCRT蛋白能显著地刺激RAW264.7细胞的增殖(SI>2)； SjCRT蛋白刺激后实验组RAW264.7细胞的MHCⅡ、TLR2和TLR4表达量显著地增强(P<0.05)。提示SjCRT蛋白能够刺激RAW264.7细胞表型的成熟，且可能与TLR2和TLR4受体介导的过程相关。为了解SjCRT是否具有活化宿主树突状细胞的功能，本研究采用上述真核表达的SjCRT蛋白刺激小鼠骨髓里来源的DC细胞，分析刺激后DC表型和功能成熟的情况。常规方法从Balb/c小鼠骨髓分离、培养和分选得到纯度较高的不成熟的DC细胞；流式细胞术检测SjCRT蛋白刺激DC细胞表面标志分子MHCⅡ、CD40和CD86的表达；ELISA法检测刺激的DC细胞培养上清中的细胞因子IFN-γ、IL-10、TNF-α和IL-6的含量。结果显示，SjCRT蛋白刺激后MHCⅡ和CD86表达显著性增强(P<0.05)；DC细胞分泌到上清中的IFN-γ显著性增多(P<0.05)，IL-10、TNF-α和IL-6显著性减少(P<0.05)。提示SjCRT蛋白能够刺激小鼠骨髓来源的DC细胞表型的成熟，且具有促进DC细胞分泌Th1类致炎细胞因子IFN-γ的功能。总之，本研究克隆表达了日本血吸虫CRT分子，观察到该分子能够在7d、10d、14d日本血吸虫童虫体表膜呈现，初步查明SjCRT蛋白能够活化宿主的树突状细胞和巨噬细胞，为进一步阐明SjCRT在RAV中的免疫生物学功能和机制奠定了基础。

全文目录


中文摘要  6-9
Abstract  9-13
英文缩略表  13-18
第一章 绪论  18-26
  1.1 血吸虫生物学概述  18-20
    1.1.1 血吸虫分类及其生活史  18-19
    1.1.2 血吸虫病的致病原理  19-20
  1.2 血吸虫疫苗研究  20-22
    1.2.1 血吸虫疫苗研制的必要性和可行性  20
    1.2.2 筛选血吸虫疫苗候选分子的策略  20-21
    1.2.3 辐照致弱（RA）血吸虫疫苗模型研究  21-22
  1.3 钙网织蛋白分子的结构与功能  22-23
    1.3.1 钙网织蛋白分子的结构与功能特征  22
    1.3.2 血吸虫钙网织蛋白分子的研究  22-23
  1.4 抗原提呈细胞与先天免疫和适应性免疫应答  23-26
    1.4.1 抗原提呈细胞的主要类型和功能  23-24
    1.4.2 血吸虫抗原活化宿主 DC 的功能及其机制  24-26
第二章 SjCRT 的原核表达及抗原性初步分析  26-38
  2.1 实验材料  27
    2.1.1 菌种、质粒、引物、试剂和仪器  27
  2.2 方法  27-32
    2.2.1 SjCRT 蛋白基因分克隆、重组、鉴定和序列分析  27-30
    2.2.2 SjCRT 蛋白的表达、纯化及免疫原性分析  30-32
  2.3 结果  32-37
    2.3.1 SjCRT 基因克隆及表达  32-34
    2.3.2 SjCRT 分子序列分析  34-35
    2.3.3 SjCRT 蛋白的纯化及其免疫原性的鉴定  35-37
  2.4 讨论  37-38
第三章 SjCRT 蛋白在血吸虫中的组织定位  38-42
  3.1 材料和方法  38-39
    3.1.1 实验材料  38-39
    3.1.2 实验方法  39
  3.2 实验结果  39-41
    3.2.1 SjCRT 定位于童虫的体被膜  39-41
  3.3 讨论  41-42
第四章 SjCRT 基因在昆虫杆状病毒表达系统中的表达  42-52
  4.1 实验材料  42-43
    4.1.1 细胞，载体和菌株  42
    4.1.2 主要试剂  42-43
  4.2 实验方法  43-45
    4.2.1 引物设计  43
    4.2.2 pFastBacHTA- SjCRT 转移载体的构建  43
    4.2.3 reBacmid-SjCRT 重组杆状病毒的构建和鉴定  43-44
    4.2.4 reBacmid-SjCRT 转染昆虫细胞  44
    4.2.5 表达蛋白的检测  44
    4.2.6 SjCRT 蛋白的纯化  44-45
    4.2.7 纯化后的 SjCRT 蛋白 Western blot 分析  45
  4.3 实验结果  45-50
    4.3.1 PCR 扩增和重组杆状病毒的构建  45-47
    4.3.2 Western blot 及 IFA 分析 SjCRT 蛋白的表达  47-49
    4.3.3 SjCRT 蛋白的纯化  49
    4.3.4 纯化后的 SjCRT 蛋白 Western blot 分析  49-50
  4.4 讨论  50-52
第五章 SjCRT 活化 RAW264.7 细胞的功能分析  52-58
  5.1 实验材料  52-53
    5.1.1 实验细胞、主要试剂及仪器  52-53
  5.2 实验方法  53-54
    5.2.1 细胞培养  53
    5.2.2 CCK-8 检测细胞增殖实验  53
    5.2.3 流式细胞术检测细胞表面分子  53-54
  5.3 实验结果  54-56
    5.3.1 SjCRT 刺激巨噬细胞 RAW264.7 的增殖  54
    5.3.2 SjCRT 上调巨噬细胞 RAW264.7 表面受体分子及 MHCII 分子的表达  54-56
  5.4 讨论  56-58
第六章 SjCRT 活化 DC 细胞的功能分析  58-68
  6.1 实验材料  58-59
    6.1.1 实验细胞、主要试剂  58-59
    6.1.2 实验仪器  59
    6.1.3 实验动物  59
  6.2 实验方法  59-62
    6.2.1 DC 细胞的制备  59-60
    6.2.2 DC 细胞的分选  60-61
    6.2.3 ELISA 检测细胞因子  61
    6.2.4 流式细胞术检测细胞表面标记  61-62
  6.3 实验结果  62-65
    6.3.1 SjCRT 上调 DC 表面共刺激分子及 MHCII 分子的表达  62-63
    6.3.2 SjCRT 促进 DC 产生 IFN-γ但降低 IL-6、IL-10、和 TNF-α的分泌  63-65
  6.4 讨论  65-68
第七章 全文总结  68-70
致谢  70-72
参考文献  72-78
硕士期间取得的研究成果  78

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 医学免疫学
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