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新城疫病毒F蛋白对其致病性影响的研究

作　者: 李晓婷
导　师: 戴美学; 司红丽
学　校: 山东师范大学
专　业: 微生物学
关键词: 新城疫 F蛋白变异性毒性全长cDNA构建
分类号: S855.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

新城疫(ND)是禽类特别是鸡类的一种具有高度传染性的病毒性疾病，引起这种疾病的病毒为新城疫病毒（NDV）。NDV是副粘病毒科（paramyxoviridae）副粘病毒亚科（paramyxovirinae）腮腺炎病毒属(rubulavirus)的一种病毒。NDV基因组为单股负链RNA病毒，编码6种蛋白。其中的F基因对其毒性起到了决定性的作用。研究发现F蛋白裂解位点的碱性氨基酸数目与NDV毒性密切相关，因此编码裂解位点氨基酸的核苷酸顺序在NDV致病性的研究中至关重要。本研究下载了在2012年11月年之前上传到美国国家生物技术信息中心(NCBI)的所有中国新城疫病毒中基因全长为1662bp的F基因核苷酸序列共329条，对其进行遗传进化分析，且对其编码的氨基酸进行变异分析。研究发现F蛋白裂解位点附近核苷酸序列具有保守性，为了研究这些序列与新城疫致病性的关系，从中国近10年发表的文献中选取在中国境内分离的18株新城疫毒株序列，并对F基因的206~540位核苷酸进行分析。研究结果表明，中国NDV有ClassⅠ和ClassⅡ两个分支，其中ClassⅡ的毒株居多。分离株中ClassⅡ的Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅸ五种基因型占到了99%，其中Ⅶ基因型的毒株数量最多，并且以Ⅶ d亚基因型为主。通过对F蛋白裂解位点氨基酸变化的研究发现，裂解位点和毒力有一定关系。因此，对中国新城疫病毒F蛋白遗传进化的分析为研究NDV毒性分子机制以及ND的防控提供了理论依据。F和HN蛋白是新城疫病毒的两种囊膜蛋白，与宿主细胞膜的融合相关。其中F蛋白是不同NDV毒性强弱的主要原因，并且F蛋白的裂解位点起到了重要作用。本文将中等毒力的Mukteswar疫苗株的F和HN基因克隆到pMD18-T载体上，构建F-pMD18-T、HN-pMD18-T质粒，并将F基因裂解位点的核苷酸突变为典型弱毒株裂解位点GRQGRL与典型强毒株裂解位点KRQKRF的核苷酸。再将基因连接到pcDNA3.0真核表达载体上，并转染到BHK-21细胞中观察细胞融合的情况，来判断F基因裂解位点与病毒毒性的关系。转染过程中同时转入了能稳定表达T7RNA聚合酶的质粒pEGFP-N3-T7及荧光蛋白基因GFP，T7RNA聚合酶表达的内转录活性使F、HN、GFP基因共表达。通过实验结果可以发现F蛋白裂解位点的确与细胞膜融合密切相关，因此其对新城疫病毒的毒性也有重要作用。RNA病毒的反向遗传系统可以定向的改变病毒的基因序列，检测人工改造后病毒的变化作用。本实验将含有新城疫病毒Mukteswar疫苗株F蛋白裂解位点的质粒F5-pMD18-T使用双重PCR的方法进行基因突变，突变为弱毒株的裂解位点GRQGRL。F5-pMD18-T与F6-pMD18-T质粒分别经SpeⅠ和EcoRⅠ双酶切之后连接为FR5-6-pMD18-T。 FR5-6-pMD18-T使用XbaⅠ、StuⅠ、VspⅠ三酶切、F1-4-pMC18用XbaⅠ和StuⅠ双酶切并回收目的片断，使用T4连接酶将目的片断连接，并用三组酶进行酶切验证，分别为XbaⅠ和StuⅠ、SnaBⅠ和StuⅠ、SnaBⅠ和Eco72Ⅰ。连接成功后将片断F1-6-pMC18用SnaBⅠ和XbaⅠ双酶切，F6-11-HT-pMC18用XbaⅠ、SnaBⅠ、VspⅠ三酶切，目的片断回收连接后鉴于拼接片断过长，使用6组酶进行酶切验证，分别是用SnaBⅠ和XbaⅠ、NcoⅠ和XbaⅠ、SacⅡ和NcoⅠ、MluⅠ、BstEⅡ、NsiⅠ。检测均正确则表明新城疫病毒Mukteswar疫苗株的全长cDNA拼接完全。本研究为新城疫病毒的反向遗传系统构建提供了基础，并且新城疫疫苗多为弱毒株或减毒株，本研究也为构建人工新城疫苗提供了理论支持。

全文目录

摘要  7-9
Abstract  9-11
第一章综述  11-19
  1 NDV 的结构蛋白  11-15
    1.1 NP 蛋白  11-12
    1.2 P 蛋白  12
    1.3 M 蛋白  12
    1.4 F 蛋白  12-14
    1.5 HN 蛋白  14-15
    1.6 L 蛋白  15
  2 NDV 致病性的分子基础  15-17
    2.1 NDV 毒力划分  15-16
    2.2 F 蛋白的致病作用  16
    2.3 HN 蛋白的致病作用  16-17
  3 新城疫疫苗  17
  4 本研究内容及意义  17-19
第二章新城疫病毒中国分离株 F 蛋白遗传进化分析  19-30
  1 实验材料  19-20
  2 实验方法  20-21
    2.1 中国新城疫病毒 F 基因变异特性分析  20-21
    2.2 中国新城疫病毒 F 基因裂解位点核苷酸变异特性分析  21
  3 实验结果与分析  21-28
    3.1 中国新城疫病毒 F 基因变异特性分析  21-25
      3.1.1 系统进化树的构建  21-23
      3.1.2 代表性 NDV F 基因进化树  23-24
      3.1.3 氨基酸序列分析  24-25
    3.2 中国新城疫病毒 F 基因裂解位点核苷酸变异特性分析  25-28
      3.2.1 F 基因裂解位点核苷酸序列的遗传进化分析  25-27
      3.2.2 氨基酸序列变异分析  27-28
  4 讨论  28-30
第三章 F 蛋白裂解位点对 BHK-21 细胞特异性膜融合的影响  30-55
  1. 实验材料  30-35
    1.1 菌株、细胞、质粒  30
    1.2 实验仪器  30-31
    1.3 实验药品、试剂、试剂盒  31-33
    1.4 常用溶液配方  33-35
  2. 实验方法  35-46
    2.1 F、HN 蛋白基因的克隆  35-41
    2.2 F 基因裂解位点基因突变  41-42
    2.3 F、HN 基因与真核表达载体的连接  42-44
    2.4 F 基因裂解位点对 BHK-21 细胞膜融合的影响  44-46
  3. 结果与分析  46-53
    3.1 F、HN 蛋白基因的克隆  46-47
    3.2 F 基因裂解位点基因突变  47-49
    3.3 F、HN 基因与真核表达载体的连接  49-51
    3.4 F 基因裂解位点对 BHK-21 细胞膜融合的影响  51-53
  4. 讨论  53-55
    4.1 基因的克隆  53
    4.2 F 基因裂解位点突变及裂解位点对细胞膜融合影响  53-55
第四章新城疫 MUKTESWAR 疫苗株全长 CDNA 中 F 基因裂解位点突变  55-74
  1. 实验材料与试剂  55-58
    1.1 细胞、质粒  55
    1.2 实验仪器  55-56
    1.3 实验药品、试剂、试剂盒  56-58
  2. 实验方法  58-66
    2.1 F 蛋白裂解位点基因突变  58-60
    2.2 新城疫 Mukteswar 疫苗株全长 cDNA 构建  60-66
  3. 结果与分析  66-72
    3.1 新城疫 Mukteswar 疫苗株 F 基因裂解位点突变  66-68
    3.2 F5R-pMD18-T 与 F6-pMD18-T 质粒的连接  68-69
    3.3 FR5-6-pMD18-T 与 F1-4-pMC18 质粒的连接  69-71
    3.4 F1-6-pMC18 与 F6-11-pMC18 质粒的连接  71-72
  4. 讨论  72-74
总结  74-75
附录  75-82
参考文献  82-89
致谢  89-90
攻读学位期间发表论文情况  90

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