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单核细胞增生李斯特菌单克隆抗体制备及荧光微球免疫层析试纸条的研制

作　者: 董香梅
导　师: 熊勇华; 许恒毅
学　校: 南昌大学
专　业: 微生物学
关键词: 单核细胞增生李斯特菌单克隆抗体外膜蛋白荧光微球免疫层析试纸条
分类号: S852.61
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

单增李斯特菌(Listeria monocytogenes,简称LM)是一种能引起人畜共患病的食源性致病菌。该菌可通过食物、水和动物粪便等传播,在低温4℃下仍能生长繁殖,人被LM感染后死亡率可达30%,在新生婴幼儿和免疫力低下的人群中死亡率更高达70%。获得高亲和力李斯特菌特异性抗体是建立免疫学检测李斯特菌的必要条件之一。本文以LM的细胞碎片免疫BALB/c小鼠,成功筛选获得了4株稳定分泌抗LM的单克隆杂交瘤细胞株4A7、4H11、10A11、11E11。抗体效价分别为1：160000、1:20000、1:160000、1:160000;抗体亚型分别为IgG1、IgG2a、IgG1、 IgG2ao Dot-ELISA结果表明,4A7、10A11和4H11单克隆抗体具有很好的属特异性。Western-blot分析表明,4A7,10A11可与.M62kDa外膜蛋白抗原表位结合；4H11抗体可与LM32kDa外膜蛋白抗原表位结合；11E11抗体结合的抗原分子量范围为14-24KDa,分析抗原成分可能是磷壁酸类物质。胶体金免疫电镜实验进一步确证以上抗体可有效识别LM细胞表面抗原。将抗LM的四株单抗4A7、4H11、10A11、11E11与抗LM兔多抗LM2以及LM3配对,结果表明抗LM单抗4A7与兔多抗LM3可以配对。以兔多抗LM3标记荧光微球,单抗4A7以及驴抗鼠IgG喷涂于硝酸纤维素膜上分别作为检测线(T线)和质控线(C线),初步建立了LM免疫层析试纸条的快速检测方法。LM荧光微球试纸条最佳实验条件如下：兔多抗LM3最佳标记量为50μg/mg(荧光微球)；NC膜上T线4A7抗体浓度为0.5mg/mL,质控线驴抗鼠二抗浓度为1mg/mL;单次检测荧光微球(5mg/mL)用量为7μL。试纸条免疫动力学分析表明,在加样后的30min内,试纸条T,C线荧光强度一直呈上升趋势,未能达到平衡；而T/C比值在20min后达到平衡。在最佳实验条件下,LM的最低检测灵敏度为4.65×107CFU/mL。初步的适用性验证实验表明,该荧光微球试纸条与受试的17株LM分离株具有较好的反应性,与属内绵羊、英诺克、威尔氏、西尔李斯特菌有一定交叉反应,试纸条与格氏李斯特菌以及属外常见30余株菌没有交叉反应。

单核细胞增生李斯特菌单克隆抗体制备及荧光微球免疫层析试纸条的研制

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