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蛋鸡卵巢CART基因的表达及蛋白定位

作　者: 于雪静
导　师: 吕丽华; George W.Smith
学　校: 山西农业大学
专　业: 动物遗传育种与繁殖
关键词: 蛋鸡卵巢膜细胞颗粒细胞 CART基因
分类号: S831.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

可卡因苯丙胺调节转录肽(CART)基因自发现以来,在药物成瘾、饮食与肥胖、内分泌等方面引起了科研人员的极大关注,并得到广泛深入的研究。2004年,Kobayashi等人首次证实了CART对牛卵巢卵泡发育有负调控作用,可引起卵泡闭锁。鉴于CART在繁殖方面的特殊作用,本试验以蛋鸡为研究对象,利用基因克隆得到CART基因序列,并与其他物种对比其同源性；应用免疫组织化学技术对蛋鸡卵巢CART进行定位,找出其蛋白表达部位；采用荧光定量技术对蛋鸡不同大小卵泡颗粒细胞和膜细胞中CART mRNA进行分析,研究其表达规律,从分子水平上为探讨CART与蛋鸡繁殖性能的关系奠定基础,为进一步研究CART对禽类繁殖方面的调控提供理论依据。本试验的研究结果及结论如下：(1)通过RT-PCR技术,发现蛋鸡卵巢有CART基因的表达,并克隆得到了蛋鸡CART基因的部分序列,共230bp。利用DNAMAN软件对比发现其与牛、猪、人等有很高的同源相似性,说明其在不同物种中具有高度的保守性。(2)免疫组化结果显示直径1-2mm卵泡和2-4mm卵泡颗粒层细胞和膜层细胞中均有CART肽的表达,且膜层表达量高于颗粒层细胞。(3)荧光定量PCR结果显示CART mRNA在不同大小卵泡膜层细胞内表达量普遍高于颗粒层细胞,这或许与膜层产生雌激素有关。(4)直径6-8mm卵泡颗粒细胞内CART mRNA表达量显著高于其他卵泡,F1卵泡颗粒细胞内CART mRNA表达量显著高于直径9-12mm卵泡、F5和F2卵泡,由于6-8mm卵泡是卵泡走向闭锁或继续发育为优势卵泡而排卵的转折点,CART基因或许在卵泡发育的关键阶段发挥着特殊作用。(5)直径4-6mm卵泡膜细胞内CART mRNA表达量显著高于其他卵泡,直径6-8mm.9～12mm卵泡与排卵前不同等级卵泡膜细胞CART mRNA相对表达量差异不显著。或许由于CART对雌激素分泌有负调控的影响,而膜层是雌激素产生的重要来源。其中F1为排卵前最大的卵泡,其直径约达40mm,F1～F5为排卵前卵泡的等级序列,其直径均大于12mm。

全文目录

摘要  8-9
引言  9-10
第一章文献综述  10-18
  1 CART的研究进展  10-13
    1.1 CART的由来  10
    1.2 CART的结构和分布  10-11
      1.2.1 CART的结构  10
      1.2.2 CART的分布  10-11
    1.3 CART的生物学机制  11-13
      1.3.1 CART与药物成瘾的关系  11
      1.3.2 CART与Ⅱ型糖尿病的关联  11-12
      1.3.3 CART与食欲的关系  12
      1.3.4 CART对激素的调节  12-13
    1.4 CART在繁殖中的研究  13
  2 禽类卵泡的生长发育  13-18
    2.1 禽类卵泡的发育特点  13-14
    2.2 卵子的发生及卵泡发育  14-15
      2.2.1 卵子发生  14
      2.2.2 卵泡发育  14-15
    2.3 禽类卵泡发育的调控  15-18
      2.3.1 卵泡发育的内分泌调控  15-17
        2.3.1.1 促性腺激素的调控  15-16
        2.3.1.2 类固醇激素的调控  16-17
      2.3.2 卵泡发育的局部调控  17-18
        2.3.2.1 胰岛素样生长因子-Ⅰ对禽类卵泡发育的调控  17
        2.3.2.2 表皮生长因子(EGF)对禽类卵泡发育的调控  17-18
第二章蛋鸡卵巢内CART基因的克隆及序列分析  18-29
  1 材料与方法  18-19
    1.1 试验动物  18
    1.2 试验主要试剂及配制  18-19
      1.2.1 主要试剂  18
      1.2.2 试验所需主要试剂的配制  18-19
    1.3 试验所需主要仪器  19
  2 试验方法  19-24
    2.1 蛋鸡小白卵泡总RNA的提取与检测  19-21
      2.1.1 小白卵泡组织总RNA的提取  19-20
      2.1.2 总RNA完整性及浓度的鉴定  20-21
        2.1.2.1 总RNA电泳检测  20
        2.1.2.2 RNA浓度的测定  20-21
    2.2 反转录反应  21
      2.2.1 去除RNA中基因组DNA  21
      2.2.2 合成cDNA第一条链  21
    2.3 引物设计与PCR反应  21-22
      2.3.1 引物的设计  21
      2.3.2 PCR反应  21-22
    2.4 凝胶电泳检测  22
    2.5 PCR产物回收、纯化与检测  22-23
      2.5.1 DNA回收  22
      2.5.2 回收DNA的检测  22-23
    2.6 基因克隆与测序  23-24
      2.6.1 目的片段与载体的连接转化  23-24
      2.6.2 测序  24
    2.7 鸡CART基因cDNA序列分析  24
  3 结果与分析  24-27
    3.1 蛋鸡卵巢小白卵泡总RNA的提取结果  24-25
    3.2 PCR扩增电泳结果  25-26
    3.3 DNA回收纯化结果  26
    3.4 CART基因克隆产物测序结果  26
    3.5 同源性比对结果  26-27
  4 讨论  27-28
  5 小结  28-29
第三章 CART在蛋鸡卵巢卵泡中的定位研究  29-33
  1 材料与方法  29-30
    1.1 试验动物及其组织  29
    1.2 试验主要试剂及配制  29-30
      1.2.1 主要试剂  29
      1.2.2 试验所需主要试剂的配制  29-30
      1.2.3 试验所需主要仪器  30
  2 试验方法  30-31
    2.1 切片的制备  30
    2.2 免疫组织化学  30-31
  3 结果与分析  31-32
  4 讨论  32
  5 小结  32-33
第四章 CART基因在不同大小卵泡中的表达  33-40
  1 材料与方法  33
    1.1 试验动物及其组织  33
      1.1.1 试验用卵泡的分离  33
      1.1.2 颗粒细胞和膜细胞的分离  33
    1.2 试验主要试剂及仪器  33
  2 试验方法  33-35
    2.1 颗粒细胞与膜细胞总RNA的提取与检测分析  33-34
    2.2 设计与合成引物  34
    2.3 目的基因CART荧光定量PCR反应  34-35
    2.4 统计学分析  35
  3 结果与分析  35-38
    3.1 颗粒细胞荧光定量结果  35-36
      3.1.1 扩增曲线结果  35
      3.1.2 熔解曲线结果  35-36
      3.1.3 不同大小卵泡颗粒细胞内CART mRNA的表达差异  36
    3.2 膜细胞荧光定量结果  36-38
      3.2.1 扩增曲线结果  36-37
      3.2.2 熔解曲线结果  37
      3.2.3 不同大小卵泡膜细胞内CART mRNA的表达差异  37-38
  4 讨论  38-39
  5 小结  39-40
全文结论  40-41
参考文献  41-45
Abstract  45-47
致谢  47

蛋鸡卵巢CART基因的表达及蛋白定位

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