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二花脸猪TGFBR2基因的克隆与表达水平分析

作　者: 张久峰
导　师: 李齐发
学　校: 南京农业大学
专　业: 动物遗传育种与繁殖
关键词: 二花脸猪 TGFBR2 序列卵巢组织表达水平 miRNA
分类号: S828
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

二花脸猪是我国太湖猪中最优秀的品种之一,以繁殖力高而闻名,但其高繁殖力遗传机制尚不明确。TGFBR2基因是转化生长因子p超家族中的一员,在哺乳动物卵巢颗粒细胞增殖、分化、卵泡发育和繁殖性能等方面发挥重要作用。目前关于TGFBR2基因与二花脸猪繁殖性能关系方面的研究还未见报道。本研究拟以我国高繁殖力猪种二花脸猪为研究对象,采用克隆测序技术获得二花脸猪TGFBR2基因编码区序列,并利用生物信息学方法分析其序列特征；采用RT-PCR技术和免疫组化技术分析二花脸猪TGFBR2基因的组织表达特征和卵巢组织细胞表达特征,并采用real-time PCR技术和western blot技术检测二花脸猪与商品猪卵巢组织中TGFBR2基因mRNA和蛋白表达水平；采用real-time PCR技术检测猪卵泡闭锁过程中TGFBR2基因mRNA表达水平的变化；采用生物信息学方法和荧光素酶双报告基因系统筛选TGFBR2基因的调控miRNA.探讨TGFBR2基因与二花脸猪高繁殖力性状形成之间的的关系,为揭示二花脸猪高繁殖力性状形成的分子机制提供理论依据。全文研究结果如下：1.二花脸猪TGFBR2基因的克隆和序列分析本研究成功获得了二花脸猪TGFBR2基因的编码区序列,序列全长为1461bp,与哺乳动物其它物种的一致性为74-84%。二花脸猪TGFBR2基因编码蛋白含486个氨基酸残基,与哺乳动物其它物种的一致为88-97%。结构域预测发现,二花脸猪TGFBR2蛋白与人、小鼠等哺乳动物一样,含有跨膜结构域、Pkc结构域等典型的功能域。三级结构预测显示二花脸猪TGFBR2蛋白由6个α-螺旋、7个β-折叠结构和不规则卷曲组成。利用TGFBR2氨基酸序列构建的哺乳动物NJ系统发育树,聚类结果与经典分类学相吻合。研究结果表明二花脸猪TGFBR2基因与哺乳动物其它物种同源性较高,推测其与其它哺乳动物TGFBR2蛋白类似,在卵泡发育过程中发挥着重要作用。2.二花脸猪TGFBR2表达特征和卵巢组织表达水平RT-PCR检测发现TGFBR2基因在二花脸猪下丘脑、垂体、卵巢等12种组织中广泛表达,特别是在卵巢组织中高表达。免疫组化分析发现TGFBR2在猪卵泡的各个发育阶段均有表达,主要分布在卵母细胞和颗粒细胞中。Real-time PCR检测发现二花脸猪卵巢组织中TGFBR2基因mRNA表达水平显著高于商品猪(P<0.05)。Western blot分析发现二花脸猪卵巢组织中TGFBR2蛋白表达水平显著高于商品猪(P<0.05)。研究结果表明卵巢组织中TGFBR2基因和蛋白表达水平可能与二花脸猪的高繁殖力有关,是影响二花脸高繁殖力性状形成的候选基因。Real-time PCR法对猪健康卵泡、早期闭锁卵泡和晚期闭锁卵泡中TGFBR2基因mRNA表达水平进行了分析,研究结果表明TGFBR2基因与猪卵泡早期闭锁有一定的关系,可能通过影响卵泡液中E2的合成影响卵泡闭锁。3.猪TGFBR2基因调控miRNA的初步筛选根据生物信息学网站预测,获得了29个调控TGFBR2基因的候选miRNA,结合课题组前期利用miRNA芯片检测猪卵泡闭锁过程中miRNA表达谱,结果发现miR-21既是TGFBR2基因的候选调控miRNAs,也是猪卵泡闭锁过程中差异表达的miRNAs(P<0.000001)。将miR-21minics和构建的TGFBR2基因3’UTR荧光素酶报告基因载体共转染Hela细胞,结果发现转染24h和48h后,miR-21minics组报告基因的活性极显著低于对照组(minics NC组)(P<0.01),说明过表达miR-21可极显著抑制报告基因的活性,验证了miR-21对猪TGFBR2基因具有调控作用,是猪TGFBR2基因的调控miRNA.

全文目录

摘要  7-9
ABSTRACT  9-12
第一章文献综述  12-22
  1 TGF-β配体  12-13
  2 TGF-β受体  13-14
  3 TGFBR2基因的结构  14
  4 TGFBR2基因的组织表达特征  14
  5 TGFBR2基因的生物学功能  14-15
  6 TGFBR2基因的调控  15-22
    6.1 Smads蛋白介导的TGFβ信号传导  15-17
    6.2 miRNA对TGFBR2的调控  17-22
第二章试验研究  22-66
  1 材料和方法  23-42
    1.1 试验动物  23
    1.2 主要试剂和仪器  23-25
    1.3 细胞系、菌株及质粒  25-28
    1.4 试验方法  28-38
    1.5 猪TGFBR2基因调控miRNA的初步筛选  38-42
    1.6 数据分析  42
  2 结果与分析  42-62
    2.1 二花脸猪TGFBR2基因序列分析  42-44
    2.2 二花脸猪TGFBR2基因氨基酸序列及理化性质分析  44-49
    2.3 二花脸猪TGFBR2蛋白三级结构及系统发育分析  49-50
    2.4 二花脸猪卵巢组织TGFBR2基因表达水平分析  50-56
    2.5 猪卵泡闭锁过程中TGFBR2基因mRNA表达水平变化  56-57
    2.6 猪TGFBR2基因调控miRNA的初步筛选  57-62
  3 讨论  62-66
    3.1 二花脸猪TGFBR2基因的序列和结构特征  62-63
    3.2 二花脸猪TGFBR2的组织表达特征和卵巢组织细胞表达特征  63
    3.3 二花脸猪卵巢组织TGFBR2转录与翻译水平  63-64
    3.4 TGFBR2在猪卵泡闭锁过程中的作用  64-65
    3.5 猪TGFBR2基因调控miRNA的初步筛选  65-66
参考文献  66-74
全文结论  74-76
全文创新点  76-78
附录  78-80
致谢  80

二花脸猪TGFBR2基因的克隆与表达水平分析

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