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猪源多能性基因的克隆与猪Oct4基因的重编程功能研究

作　者: 张鑫淼
导　师: 夏平
学　校: 东北农业大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 猪多能性基因基因克隆过表达 Oct4 重编程
分类号: S828
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

猪诱导多能性干细胞在再生医学及生产经济等方面具有重要的研究意义与应用价值。目前已有多个实验组报道建立了猪诱导多能性干细胞系,但只有一组提出他们建立的猪iPS细胞可能具有形成嵌合体的能力,而且目前为止所有报道的猪诱导多能性干细胞系均没有达到外源基因沉默的标准。导致猪诱导多能性干细胞不完全重编程的原因可能是目前所使用的诱导因子均来源于鼠和人,而并非猪本源。异源的诱导因子由于物种间的蛋白差异,可能无法有效与猪内源DNA和蛋白相互作用,激活内源多能性调控网络。另外,由猪特异性的早期胚胎发育模式推测,适用于小鼠和人的重编程因子组合(Oct4,Sox2,Klf4,c-Myc)可能并不足以完全重编程而获得猪诱导多能性干细胞,而需要其他因子共同作用。为了优化猪诱导多能性干细胞系的建立体系、更好的理解猪诱导多能性干细胞的重编程机制,本研究拟克隆猪内源多能性基因,并通过在猪成纤维细胞中的过表达分析研究其在重编程过程中的机制。所涉研究内容及主要结果如下：首先,我们利用RT-PCR的方法获得了七种猪源多能性基因的完整编码区,包括Oct4,Sox2,Klf4,c-Myc,Nanog, Eras, Tell基因,克隆基因与NCBI和Ensemble数据库中提交的信息序列匹配度均在99%以上,除Nanog之外其余蛋白匹配度均为100%。另外由于猪Nr5a2基因的基因组序列不完整,无参考序列,我们利用同源比对预测了猪Nr5a2基因的编码区序列,PCR扩增得到了特异性序列,通过5’和3’RACE的方法我们进一步确认了我们克隆的猪Nr5a2基因的准确性和完整性,同时获得了Nr5a2基因的两种转录变异体,首次克隆得到了猪Nr5a2基因mRNA的全长序列。我们同时分析了Nr5a2基因在猪中各组织及阶段早期胚胎表达情况。结果表明Nr5a2基因表达于多种组织中,除卵巢组织表达非常强烈之外,肝、胰、肠、肌肉均相对表达量较高。在早期胚胎中Nr5a2表达量相对较高,并随着胚胎发育,Nr5a2基因的表达有逐渐升高的趋势,至囊胚中表达量最高。。以此,我们共成功克隆了八种猪内源多能性基因可用于对猪诱导多能性干细胞系建立技术及机制的探索。其次,我们对克隆的猪源基因进行了同源性分析、系统进化树分析和结构域差异分析。系统研究了这几种基因的物种差异性,并分析了外源诱导因子的差异性可能导致的对不完全重编程的影响。分析结果显示Sox2基因和Nr5a2基因在物种间相对保守,与其他哺乳动物物种的同源蛋白均在90%以上,而Oct4,Klf4,c-Myc基因在物种间的同源性则与物种类别有关,猪Oct4,Klf4,c-Myc和Eras的蛋白结构与其他偶蹄类动物相应的蛋白同源性最高,而与灵长类和啮齿类的同源性则逐渐降低。而Tcll蛋白结构显示出明显的物种差异性,不同物种间的差异较为明显。系统进化树分析进一步验证了这一结果。另外Oct4和Nanog蛋白在其与DNA结合的位点上与小鼠和人的蛋白序列有差异,另外Klf4蛋白在其锌指结构域临近区与小鼠和人Klf4蛋白多出连续的15个氨基酸。这些位点的差异可能影响跨物种诱导多能性细胞的诱导效果。接着,我们重点研究了Oct4基因在成纤维细胞中的过表达对细胞重编程的影响。Oct4基因多能性的维持及重建中均具有关键作用,但在诱导重编程过程的研究机制还研究较少。我们的结果发现Oct4基因参与激活几条诱导多能性干细胞过程中的必经途径,包括细胞周期、细胞连接和表观遗传修饰。过表达Oct4的成纤维细胞可使多能性基因上调。过表达Oct4基因的成纤维细胞激活了多种多能性基因的表达,Sox2,c-Myc和Tel1的表达量均提高了3倍左右,而Klf4和Nanog基因的表达量上调4-6倍,1in28和utfl基因的表达量上调了7-10倍。过表达Oct4的成纤维细胞增殖能力提高,倍增时间缩短。而且Oct4基因的过表达使细胞周期中调控G1,G2期通过的相关基因cdc25a,cdk2,ccnel ccnb2,ccnf表达上调。另外,Oct4基因的过表达诱导猪胎儿成纤维细胞产生类似于胚胎干细胞样的克隆,与之对应的形成紧密连接的相关基因cldnl1, cldn3和ocln在细胞中表达量有所提高。另外Oct4的过表达还使aridela, jarid1b,setdb1,dnmt3b等与DNA甲基化、组蛋白乙酰化相关基因上调。

全文目录

摘要  9-11
Abstract  11-13
1 前言  13-30
  1.1 多能性基因概述  13-20
    1.1.1 多能性与多能性基因  13-14
    1.1.2 多能性基因与多能性调控  14-17
    1.1.3 多能性基因与细胞重编程  17-20
  1.2 猪诱导多能性干细胞研究进展  20-25
  1.3 关键多能性基因的作用  25-29
    1.3.1 Nanog基因与多能性  25-26
    1.3.2 Nr5a2基因与多能性  26-27
    1.3.3 Tcll与多能性  27-28
    1.3.4 Eras与多能性  28-29
  1.4 本研究的目的和意义  29-30
2 材料与方法  30-51
  2.1 实验材料  30-35
    2.1.1 实验动物  30
    2.1.2 主要仪器与设备  30-31
    2.1.3 主要试剂及试剂盒  31
    2.1.4 常用试剂及配制  31-35
    2.1.5 主要的生物信息学网站及分析软件  35
  2.2 实验方法  35-51
    2.2.1 组织与胚胎样本收集和保存  35-36
    2.2.2 RNA提取  36-40
    2.2.3 基因克隆  40-46
    2.2.4 感受态细胞的制备与转化  46-47
    2.2.5 质粒提取  47-48
    2.2.6 逆转录病毒表达载体构建  48
    2.2.7 猪胎儿成纤维细胞培养、感染  48-50
    2.2.8 免疫荧光鉴定  50
    2.2.9 生长曲线测定  50
    2.2.10 Realtime-PCR检测过表达 Oct4后相关基因表达  50-51
3 结果与分析  51-93
  3.1. 猪源多能基因的克隆与分析鉴定  51-84
    3.1.1 猪Oct4基因的克隆与生物信息学分析  51-55
    3.1.2 猪Sox2基因的克隆与生物信息学分析  55-60
    3.1.3 猪Klf4基因的克隆与生物信息学分析  60-65
    3.1.4 猪c-Myc基因的克隆与生物信息学分析  65-70
    3.1.5 猪Nanog基因的克隆与生物信息学分析  70-75
    3.1.6 猪Nr5a2基因的克隆与生物信息学分析  75-80
    3.1.7 猪Tcll基因的克隆与生物信息学分析  80-82
    3.1.8 猪Eras基因的克隆与生物信息学分析  82-84
  3.2 猪Oct4基因重编程功能的研究  84-93
4 讨论  93-99
  4.1 克隆猪多能性基因模板的选择  93
  4.2 猪Nr5a2基因的克隆及表达分析  93-94
  4.3 猪多能基因结构分析  94
  4.4 猪Oct4基因的克隆及序列分析  94
  4.5 猪Oct4基因过表达逆转录病毒载体过表达水平鉴定  94-95
  4.6 猪Oct4基因激活多能基因的表达分析  95
  4.7 猪Oct4基因主要通过缩短G1和G2期来提高细胞增殖能力  95-96
  4.8 猪Oct4基因对表观遗传修饰基因的影响  96-97
  4.9 猪Oct4基因对细胞连接的影响  97-99
5 结论  99-100
致谢  100-101
参考文献  101-106
攻读博士期间已发表的论文  106

猪源多能性基因的克隆与猪Oct4基因的重编程功能研究

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