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毛白杨Phi类谷胱甘肽转移酶基因的克隆及生化特性研究

作　者: 李迪
导　师: 杨海灵
学　校: 北京林业大学
专　业: 生化与分子生物学
关键词: 谷胱甘肽转移酶毛白杨克隆蛋白结构酶活性分析
分类号: S792.117
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

谷胱甘肽转移酶(G1utathione S-transferases,GSTs,EC2.5.1.18)是一类具有多种生理功能的蛋白质超家族,它在植物抗逆、解毒等方面都发挥着重要作用。本文从毛白杨(Populus tomentosa)中克隆得到2个Phi类GST基因(PtoGSTF1和PtoGSTF2),对该基因的基因结构、系统进化、表达模式、蛋白结构与生化功能进行了详细的研究,其主要结果如下：1、PtoGSTF1(?)口FtoGSTF2两个基因分别编码215和218个氨基酸的蛋白质,理论分子量分别为24.32kDa和24.57kDa。其DNA序列显示这两个基因均含有2个内含子。由蛋白质三维结构模拟发现PtoGSTF1(?)口PtoGSTF2都具有典型的Phi类GST结构特征,并且两个蛋白的结构高度相似。2、组织表达模式分析表明在正常生长的毛白杨中,PtoGSTF1和PtoGSTF2两个基因在其根、茎、叶、韧皮部和顶芽组织中都有表达,是组成型表达基因。3、在大肠杆菌中表达并纯化了这两个基因的重组蛋白。酶活性分析显示PtoGSTF1(?)口PtoGSTF2蛋白对底物CDNB、NBD-C1、NBC不口Cum-OOH都具有酶学活性,但活性差异较大。动力学分析显示PtoGSTF2对NBD-C1的亲和力比PtoGSTF1高2.5倍,但催化效率比PtoGSTF1低56.8倍。热力学稳定性分析显示PtoGSTF1比PtoGSTF2具有更高的热力学稳定性。因此,由于其基因结构与酶学性质的差异,预示着这两个Phi类GST基因可能存在功能上的分化。

全文目录

摘要  3-4
Abstract  4-8
1 前言  8-18
  1.1 GSTs家族的分类与命名  8-9
    1.1.1 分类  8-9
    1.1.2 命名  9
  1.2 GSTs家族的结构特点  9-11
  1.3 GSTs的表达与调控  11-13
  1.4 GSTs家族的功能  13-16
    1.4.1 GSTs的解毒作用  13-14
    1.4.2 GSTs的抗氧化作用  14-15
    1.4.3 GSTs的其它功能  15-16
  1.5 PHI类GSTs简介  16-17
  1.6 研究进展与展望  17-18
2 毛白杨PHI类GST基因的分子克隆及序列分析  18-33
  2.1 材料与方法  18-23
    2.1.1 实验材料  18
    2.1.2 克隆引物的设计  18-19
    2.1.3 基因组DNA的提取  19
    2.1.4 cDNA的制备  19-21
      2.1.4.1 总RNA的提取  19-20
      2.1.4.2 RNA的DNase处理  20
      2.1.4.3 cDNA的合成  20-21
    2.1.5 PCR扩增目的基因  21
    2.1.6 PCR产物割胶回收  21-22
    2.1.7 克隆载体的构建和测序  22-23
      2.1.7.1 连接  22
      2.1.7.2 转化  22-23
      2.1.7.3 菌落PCR检测  23
    2.1.8 蛋白质结构域分析  23
    2.1.9 系统发生关系分析  23
    2.1.10 序列相似性分析  23
    2.1.11 毛白杨GSTF蛋白的结构模拟  23
  2.2 结果与分析  23-32
    2.2.1 毛白杨基因组DNA与总RNA的提取  23-24
      2.2.1.1 毛白杨基因组DNA的提取  24
      2.2.1.2 毛白杨总RNA的提取  24
    2.2.2 目的基因的扩增  24-25
      2.2.2.1 基因组目的基因的扩增  24-25
      2.2.2.2 cDNA目的基因的扩增  25
    2.2.3 克隆载体的构建与鉴定  25-27
    2.2.4 目的基因的测序结果及序列分析  27-28
    2.2.5 毛白杨Phi类GST蛋白质结构分析  28
    2.2.6 蛋白质结构模拟  28-29
    2.2.7 多序列比对分析  29-31
    2.2.8 系统进化分析  31-32
  2.3 讨论  32-33
3 毛白杨PHI类GST基因的表达模式分析  33-37
  3.1 材料与方法  33-34
    3.1.1 实验材料  33
    3.1.2 PCR引物的设计  33
    3.1.3 各组织总RNA的提取  33
    3.1.4 RNA的DNase处理  33
    3.1.5 cDNA的合成  33
    3.1.6 PCR反应  33-34
  3.2 结果与分析  34-36
    3.2.1 毛白杨总RNA的提取  34-35
    3.2.2 毛白杨cDNA的检测  35
    3.2.3 PCR结果检测  35-36
  3.3 讨论  36-37
4 毛白杨PHI类GST蛋白质的表达、纯化及生化性质研究  37-47
  4.1 实验方法  37-41
    4.1.1 表达引物的设计  37
    4.1.2 PCR扩增目的基因  37
    4.1.3 PCR产物割胶回收  37
    4.1.4 克隆载体的构建和测序  37
    4.1.5 表达载体的构建  37-40
      4.1.5.1 质粒提取  37-38
      4.1.5.2 双酶切反应  38
      4.1.5.3 连接  38-39
      4.1.5.4 感受态细胞的制备  39
      4.1.5.5 转化  39
      4.1.5.6 菌落PCR检测  39-40
    4.1.6 融合蛋白的原核表达  40
    4.1.7 蛋白质的纯化  40
    4.1.8 蛋白质酶学活性测定  40-41
      4.1.8.1 底物活性测定  40-41
      4.1.8.2 酶促动力学分析  41
      4.1.8.3 热力学稳定性分析  41
  4.2 结果与分析  41-46
    4.2.1 克隆测序  41-42
    4.2.2 表达载体的构建  42-43
      4.2.2.1 质粒的提取及酶切  42
      4.2.2.2 表达载体的构建与鉴定  42-43
    4.2.3 融合蛋白的体外诱导表达和纯化  43-44
    4.2.4 蛋白活性的测定  44-46
      4.2.4.1 底物活性的测定  44-45
      4.2.4.2 酶促动力学分析  45
      4.2.4.3 热力学稳定性分析  45-46
  4.3 讨论  46-47
5 总结  47-49
参考文献  49-54
个人简介  54-55
导师简介  55-56
致谢  56

毛白杨Phi类谷胱甘肽转移酶基因的克隆及生化特性研究

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