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核桃DELLA蛋白编码基因的克隆及分析

作　者: 宋晓波
导　师: 张志华
学　校: 河北农业大学
专　业: 果树学
关键词: 核桃 DELLA 基因克隆 RACE技术生物信息学
分类号: S664.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

核桃(Juglans regia L.)树高常达10~25m,干径可达1m左右,冠幅直径6~16m,属落叶乔木,是我国重要的经济树种。目前核桃栽培大多采用大冠稀植和乔化密植,导致树冠大,栽培管理困难,树冠郁闭,影响通风透光,果实品质差,经济效益低。矮化栽培因具有结果早、品质好、管理方便、品种更新快等优点,已成为果树业发展的趋势。本试验以矮化型核桃品种‘辽宁2号’为试材,通过同源克隆和RACE技术克隆得到了核桃DELLA蛋白编码基因的cDNA全长,并通过生物信息学软件进行了分析,旨在从分子水平研究果树的矮化机理,为核桃的矮化育种工作奠定基础。主要结果如下:1.根据已知的DELLA蛋白编码基因的保守序列设计引物,以‘辽宁2号’核桃嫩叶cDNA为模板,扩增得到长为449 bp的一段cDNA片段,通过Blastn比对,该片段与葡萄的DELLA蛋白编码基因(Genebank:EF141255)同源性达到81%。该片段编码149个氨基酸,Blastp比对结果显示:该氨基酸片段同小金海棠(Genebank:ADH53781)和苹果(Genebank:ADH53780)的DELLA蛋白同源性最高分别为92%和91%。证明克隆得到序列为DELLA蛋白编码基因的一部分。2.在此序列的基础上进行3′端和5′端RACE扩增。最终获得到2,361 bp的cDNA全长序列,包含1,842 bp的完整的开放阅读框(ORF),158 bp的5′非翻译区,349bp3′非翻译区及12bp的poly A。将该基因命名为JrGAI(Genebank:JF766606)。3.该基因编码的DELLA蛋白包含613个氨基酸(Genebank:AEE69074),推测其分子量为66.78kDa。同源性分析结果表明该蛋白与其他物种DELLA蛋白高度相似,与毛果杨关系最近,相似度达98%。对其氨基酸序列进行生物信息学分析,将其与毛果杨、番茄、五叶地锦和拟南芥进行多重比对,发现不同物种DELLA蛋白的氨基酸序列在N端的同源性总体上不高,但存在DELLA和TVHYNP两个非常保守的酸性结构域,中部有一个核定位信号结构域(N LS)RKVATYFGLARR,C端有RVER和SAW两个保守结构域。证明核桃的DELLA蛋白具有同其他物种相似的功能。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-7
缩略词表  7-10
1 引言  10-18
  1.1 果树矮化栽培技术研究进展  10-11
    1.1.1 矮化砧木的应用  10-11
    1.1.2 矮化品种选育的研究  11
    1.1.3 矮化管理措施  11
  1.2 果树矮化机理的研究进展  11-17
    1.2.1 树体解剖结构及生理生化性状与生长势的关系  11-12
    1.2.2 矮化基因的标记、分离以及现代生物技术在果树矮化育种中的应用  12-17
  1.3 选题目的及意义  17-18
2 材料与方法  18-32
  2.1 试验材料  18-19
    2.1.1 植物材料  18
    2.1.2 主要试剂  18
    2.1.3 主要仪器设备  18-19
  2.2 试验方法  19-32
    2.2.1 总RNA 的提取和鉴定  19-20
    2.2.2 DELLA 蛋白编码基因保守区片段的克隆  20-24
    2.2.3 核桃DELLA 蛋白编码基因5′端序列的克隆  24-25
    2.2.4 5′RACE 扩增  25-27
    2.2.5 5′RACE 序列验证  27-28
    2.2.6 核桃DELLA 蛋白编码基因3′端序列的克隆  28-30
    2.2.7 3′RACE 序列验证  30
    2.2.8 核桃DELLA 蛋白编码基因cDNA 全长的克隆  30-31
    2.2.9 核桃DELLA 蛋白编码基因的生物信息学分析  31-32
3 结果与分析  32-47
  3.1 核桃叶片Total RNA 的提取  32
  3.2 核桃 DELLA 蛋白编码基因cDNA 片段的克隆  32-34
    3.2.1 RT-PCR  32-33
    3.2.2 PCR 产物的克隆  33
    3.2.3 Jr-f-GAI 的序列分析  33-34
  3.3 核桃 DELLA 蛋白编码基因cDNA 5'端克隆结果  34-37
    3.3.1 5′同源克隆结果  34-36
    3.3.2 5′RACE 结果  36-37
  3.4 核桃 DELLA 蛋白编码基因cDNA 3'端克隆结果  37-38
  3.5 核桃DELLA 蛋白编码基因cDNA 全长序列的拼接与分析  38-41
    3.5.1 全长序列的拼接与分析  38-40
    3.5.2 全长序列的验证  40-41
  3.6 核桃DELLA 蛋白生物信息学分析  41-47
    3.6.1 氨基酸序列的组成情况  41-42
    3.6.2 推导的氨基酸序列与其它植物DELLA 蛋白氨基酸序列的同源性分析  42-46
    3.6.3 推导氨基酸序列的功能结构域分析  46-47
4 讨论  47-50
  4.1 核桃组织RNA 的提取  47-48
  4.2 核桃DELLA 蛋白编码基因cDNA 全长的克隆  48-49
  4.3 关于核桃DELLA 蛋白氨基酸序列分析  49-50
5 结论  50-51
参考文献  51-55
附录  55-58
作者简历  58-59
致谢  59-60

核桃DELLA蛋白编码基因的克隆及分析

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