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抗寒无核葡萄新种质创制及抗寒相关基因的克隆

作　者: 牛茹萱
导　师: 张剑侠
学　校: 西北农林科技大学
专　业: 果树学
关键词: 葡萄抗寒性胚挽救抗寒相关基因克隆
分类号: S663.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

无核葡萄品质优良且食用方便。因此，选育优质无核葡萄品种已成为世界葡萄育种研究的重要课题。生产上栽培的葡萄品种多属于欧亚种（Vitis vinifera），品质优良但抗寒性差，限制了其在寒冷地区的发展。因此，利用野生葡萄资源的抗寒性，将抗寒基因通过杂交或转基因手段转入欧亚种葡萄中以培育抗寒葡萄新品种是解决生产问题的根本途径。本研究以抗寒的中国野生山葡萄（Vitis amurensis）及其杂种F1(Vitis vinifera×Vitis amurensis)作父本，以欧亚种无核葡萄作母本，进行了抗寒无核葡萄胚挽救研究；此外，对课题组前期构建山葡萄抗寒基因cDNA文库获得的相关EST序列进行了半定量PCR分析，进一步克隆获得了VaERD基因和VaGLU基因全长，并初步进行了表达分析。具体结果如下：1、抗寒无核葡萄胚挽救研究（1）胚挽救最佳取样时期的确定为提高种子败育型无核葡萄胚挽救中胚的发育率和成苗率，以无核品种红无籽露、波尔莱特、皇家秋天为试材，研究了它们在自然授粉条件下胚挽救的最佳取样时期。结果表明，红无籽露、波尔莱特、皇家秋天的最佳取样时期分别为花后51~53d、55d和66d。（2）适宜胚培养的培养基的筛选接种红无籽露、波尔莱特和皇家秋天自然授粉胚珠在7种不同培养基上，筛选获得了最适宜培养基为MM4+0.5mg/L GA3+1.5mg/L IAA+500mg/L水解酪蛋白+60g/L蔗糖+1.5g/L活性炭+10.0μmol/L ZnSO4+1.0mmol/L甘氨酸+1.0mmol/L半胱氨酸+100.0mmol/L甘露醇。红无籽露、波尔莱特、皇家秋天的胚珠发育率和成苗率分别为：15.00%和6.67%，24.00%和10.00%，15.26%和5.00%，平均达到15.26%和6.84%。通过本研究共获得无核葡萄胚挽救新种质98个株系。（3）父母本对胚挽救效果的影响以2个种子败育型无核品种波尔莱特、红无籽露作母本，以抗病、抗寒性强的中国野生山葡萄品种（株系）黑龙江实生、双优及欧山杂种北醇、00-1-10（玫瑰香×黑龙江实生）分别作父本杂交，授粉51d后将胚珠分别接种于ER和MM4培养基上进行胚挽救，培养60d后在WPM+BA0.2mg/L培养基上诱导成苗。结果表明，2个母本品种胚挽救的适宜培养基不同，波尔莱特作母本适合于ER培养基，红无籽露作母本适合于MM4培养基。2个母本基因型对胚珠的发育率和成苗率的影响差异不大，波尔莱特略优于红无籽露；但4个父本基因型对胚挽救效果影响较大，以欧山杂种00-1-10和北醇作父本的杂交组合胚珠的发育率和成苗率明显高于山葡萄黑龙江实生、双优作父本的杂交组合。通过本研究共获得抗寒无核葡萄新种质为50个株系。2、山葡萄抗寒相关基因（VaERD和VaGLU）cDNA及基因全长克隆及序列分析在已有ERD和GLU的EST序列基础上，分别设计和合成特异引物，通过RACE技术，克隆获得了山葡萄株系黑龙江实生抗寒相关基因（ERD和GLU）的完整cDNA序列，分别为685bp和1019bp，命名为VaERD和VaGLU（GenBank登录号为：JQ687321和JQ687320）。根据这两个基因完整序列的开放阅读框区域设计引物，克隆获得了VaERD和VaGLU的部分DNA序列，VaERD内含子大小为88bp，VaGLU无内含子序列。3、山葡萄抗寒相关基因（VaERD、VaGLU、VaECH和VaRD22）在mRNA水平的表达变化情况用半定量PCR技术，对黑龙江实生抗寒相关基因在mRNA水平的表达变化情况进行分析。结果表明，冷胁迫后这4个基因在叶片中表达均有上调，其中，VaERD在12h时表达量最高，VaGLU在2h时表达量开始升高，之后下降，在24-48h表达量再次上升；VaECH和VaRD22在冷胁迫24h时表达量分别达到最高；在茎中，VaERD和VaRD22分别在48h、2h表达量最高；在根中VaGLU和VaRD22未有扩增出条带而VaERD和VaECH分别在根中24h、6h表达量最高。这说明4个基因能够受冷胁迫诱导表达。

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摘要  6-8
ABSTRACT  8-13
第一章文献综述  13-25
  1.1 葡萄种质资源的抗寒性  13-15
    1.1.1 抗寒性的概念  13
    1.1.2 抗寒性鉴定的方法  13-14
    1.1.3 葡萄抗寒性研究进展  14-15
  1.2 国内外葡萄抗寒育种研究进展  15-20
    1.2.1 常规育种  15
    1.2.2 无核葡萄胚挽救育种  15-20
  1.3 植物抗寒基因研究进展  20-24
    1.3.1 抗寒相关基因研究进展  20-21
    1.3.2 ERD（早期脱水应答）基因研究进展  21
    1.3.3 GLU（β-葡聚糖酶）基因研究进展  21-22
    1.3.4 葡萄抗寒基因工程  22-24
  1.4 本研究的目的意义  24-25
第二章抗寒无核葡萄胚挽救研究  25-33
  2.1 材料与方法  25-26
    2.1.1 材料  25-26
    2.1.2 方法  26
  2.2 结果与分析  26-31
    2.2.1 不同接种时期对胚挽救的影响  26-27
    2.2.2 亲本基因型对胚挽救的影响  27-28
    2.2.3 基本培养基对胚挽救的影响  28-29
    2.2.4 氨基酸及添加物对胚挽救的影响  29-31
  2.3 讨论  31-33
    2.3.1 关于胚珠最佳取样时期的确定  31
    2.3.2 关于亲本基因型对胚挽救效果的影响  31
    2.3.3 关于适宜基本培养基的筛选  31-32
    2.3.4 关于氨基酸及添加物对胚挽救效果的影响  32-33
第三章抗寒相关基因研究  33-48
  3.1 材料  33
    3.1.1 植物材料  33
    3.1.2 菌株、质粒、酶和生化试剂  33
    3.1.3 EST 序列  33
  3.2 方法  33-39
    3.2.1 VaERD 和 VaGLU cDNA 序列及基因全长克隆  33-37
    3.2.2 半定量 RT-PCR 分析  37-39
  3.3 结果与分析  39-47
    3.3.1 VaERD 和 VaGLU cDNA 序列及 DNA 序列的克隆  39
    3.3.2 VaERD 序列分析  39
    3.3.3 VaERD 基因序列同源性比对  39-42
    3.3.4 VaGLU 序列分析  42-43
    3.3.5 VaGLU 基因序列同源性比对  43-45
    3.3.6 抗寒相关基因的半定量分析  45-47
  3.4 讨论  47-48
    3.4.1 关于 VaERD 基因的功能与潜在应用  47
    3.4.2 关于 VaGLU 基因的功能与潜在应用  47-48
第四章结论  48-49
参考文献  49-56
致谢  56-57
作者简介  57

抗寒无核葡萄新种质创制及抗寒相关基因的克隆

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