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水稻谷胱甘肽过氧化物酶基因OsGPX3和OsGPX4的分子特性研究

作　者: 韦金池
导　师: 杨海灵
学　校: 北京林业大学
专　业: 生化与分子生物学
关键词: 谷胱甘肽过氧化物酶水稻克隆蛋白结构酶活性分析
分类号: S511
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase, GPX, EC1.11.1.9)广泛存在于动物、植物、真菌及细菌等生物体内,是清除活性氧的一种关键酶,在抗氧化胁迫中发挥重要作用。本研究从水稻(Oryza sativa)中克隆了两个GPX基因,分别命名为OsGPX3和OsGPX4,并对这两个基因进行了基因结构、系统发生关系、组织表达谱、蛋白质结构及酶活性等研究,主要结果如下：1、克隆得到水稻OsGPX3和OsGPX4基因的cDNA序列,它们分别包括717bp和705bp的开放阅读框,并分别编码238和234个氨基酸组成的蛋白质,预测分子量是25.84kDa和25.07kDa。两个基因都包含6个外显子,且对应的外显子长度相似,但内含子长度差异较大。蛋白序列相似性分析发现植物GPX序列有较大的相似性,并且.含有3个保守的Cys残基,系统发生关系分析发现OsGPX3和OsGPX4与其它物种的GPX聚成一枝,并且有很高的支持率。蛋白质三维结构模拟发现OsGPX3和OsGPX4蛋白的三维结构具有典型的硫氧还蛋白(TRX)结构域,包含6个β折叠和4个α螺旋结构。2、通过RT-PCR的方法,检测了水稻OsGPX3和OsGPX4基因在正常生长的水稻不同部位(根、茎、成熟叶、幼叶和叶鞘)中的表达分布,结果发现OsGPX3和OsGPX4基因在水稻根、茎、成熟叶、幼叶和叶鞘中均表达,是组成型表达基因。3、在大肠杆菌中表达并通过镍离子吸附层析纯化了OsGPX3和OsGPX4蛋白,酶活性分析显示OsGPX3和OsGPX4蛋白对底物H202、tBOOH和COOH具有较高活性,OsGPX3对三种底物的活性分别为2.80±0.03、1.19±0.04、2.99±0.05μmol/minper mg,OsGPX4对三种底物的活性分别为1.26±0.01,0.70±0.01、1.31±0.02(μmol/min per mg。 OsGPX3对三种底物的活性均高于OsGPX4,预示着这两个蛋白可能存在功能上的分化。本研究经过整合序列分析、基因表达、酶活性及蛋白质三维结构数据,在水稻中鉴定出了组成型表达的具有广谱抗过氧化物功能的OsGPX3和OsGPX4基因,为深入揭示GPX在植物抗氧化胁迫中的独特作用,及利用具有广谱抗过氧化物功能的GPX对植物进行遗传改良,提高其抗氧化胁迫的能力奠定了基础。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-7
目录  7-11
1 前言  11-25
  1.1 生物抗氧化胁迫的背景介绍  11-12
    1.1.1 生物体内的活性氧  11
    1.1.2 生物体内抗氧化胁迫的机制  11-12
  1.2 谷胱甘肽过氧化物酶的研究进展  12-23
    1.2.1 动物谷胱甘肽过氧化物酶  12-15
      1.2.1.1 动物GPX的发现与分类  13-14
      1.2.1.2 动物GPX的结构  14-15
    1.2.2 植物谷胱甘肽过氧化物酶  15-19
      1.2.2.1 植物GPX的克隆研究  15
      1.2.2.2 植物GPX的表达特异性与抗性研究  15-16
      1.2.2.3 植物GPX催化性质的研究  16-19
      1.2.2.4 植物GPX亚细胞定位的研究  19
    1.2.3 谷胱甘肽过氧化物酶的进化模式研究  19-23
  1.3 本研究的目的与意义  23-25
2 水稻OsGPX3和OsGPX4基因的克隆及序列和蛋白结构分析  25-45
  2.1 材料  25
    2.1.1 实验材料  25
    2.1.2 工具酶与试剂  25
  2.2 实验方法  25-33
    2.2.1 水稻OsGPX3和OsGPX4序列的扩增  25-30
      2.2.1.1 水稻GPX基因序列的鉴定与命名  25
      2.2.1.2 克隆引物的设计  25-26
      2.2.1.3 总RNA提取  26-27
      2.2.1.4 DNase Ⅰ处理RNA样品  27
      2.2.1.5 反转录合成cDNA  27-28
      2.2.1.6 PCR扩增OsGPX3和OsGPX4基因  28-29
      2.2.1.7 PCR产物胶同收与纯化  29
      2.2.1.8 加A反应及反应产物液体纯化  29-30
    2.2.2 水稻OsGPX3和OsGPX4克隆载体的构建  30-32
      2.2.2.1 连接  30-31
      2.2.2.2 感受态细胞JM109的制备  31
      2.2.2.3 转化  31-32
      2.2.2.4 菌落PCR检测及测序验证  32
    2.2.3 水稻OsGPX3和OsGPX4基因的序列和蛋白结构分析  32-33
      2.2.3.1 基因结构分析  32
      2.2.3.2 系统发生关系分析  32-33
      2.2.3.3 蛋白质的保守结构域分析  33
      2.2.3.4 蛋白质三维结构模拟  33
  2.3 结果与分析  33-42
    2.3.1 总RNA的提取  33-34
    2.3.2 PCR扩增OsGPX3和OsGOX4基因  34
    2.3.3 克隆载体的鉴定与测序结果  34-37
    2.3.4 水稻OsGPX3和OsGPX4的基因结构分析  37
    2.3.5 水稻OsGPX3和OsGPX4蛋白序列与系统发生关系分析  37-40
    2.3.6 水稻OsGPX3和OsGPX4蛋白质保守结构域的分析  40-41
    2.3.7 水稻OsGPX3和OsGPX4的蛋白质三维结构模拟  41-42
  2.4 讨论  42-45
3 水稻OsGPX3和OsGPX4基因的表达谱研究  45-49
  3.1 材料  45
    3.1.1 实验材料  45
    3.1.2 工具酶与试剂  45
  3.2 实验方法  45-46
    3.2.1 PCR引物设计  45
    3.2.2 不同部位总RNA提取  45
    3.2.3 DNaseⅠ处理总RNA样品  45
    3.2.4 反转录合成cDNA  45-46
    3.2.5 PCR反应  46
  3.3 结果与分析  46-48
    3.3.1 不同部位总RNA的提取  46-47
    3.3.2 OsGPX3和OsGPX4基因的表达谱  47-48
  3.4 讨论  48-49
4 水稻OsGPX3和OsGPX4蛋白表达、纯化及酶活性分析  49-63
  4.1 材料  49
    4.1.1 实验材料  49
    4.1.2 工具酶与试剂  49
  4.2 实验方法  49-56
    4.2.1 目的序列的获得  49-51
      4.2.1.1 表达引物的设计  49
      4.2.1.2 PCR扩增目的序列  49-50
      4.2.1.3 目的序列的回收与纯化  50
      4.2.1.4 目的序列与pGEM-T载体连接  50
      4.2.1.5 转化及菌落PCR检测  50-51
    4.2.2 水稻OsGPX3和OsGPX4基因表达载体的构建  51-53
      4.2.2.1 质粒提取  51
      4.2.2.2 质粒双酶切  51-52
      4.2.2.3 双酶切产物与pET30a载体连接  52-53
      4.2.2.4 转化、菌落PCR检测及测序验证  53
    4.2.3 水稻OsGPX3和OsGPX4融合蛋白的表达与纯化  53-55
    4.2.4 水稻OsGPX3和OsGPX4蛋白的酶活性测定  55-56
  4.3 结果与分析  56-61
    4.3.1 PCR扩增目的序列  56-57
    4.3.2 菌落PCR结果  57
    4.3.3 质粒提取和双酶切结果  57-58
    4.3.4 表达载体的构建  58-59
    4.3.5 蛋白表达与纯化结果  59-61
    4.3.6 水稻OsGPX3和OsGPX4酶活性测定结果  61
  4.4 讨论  61-63
5 总结  63-65
参考文献  65-71
个人简介  71-72
导师简介  72-74
致谢  74-75
缩略语表  75

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中图分类: > 农业科学 > 农作物 > 禾谷类作物 > 稻
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