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大丽轮枝菌对黄栌植株的侵染特点及其定量检测研究

作　者: 王妍
导　师: 田呈明
学　校: 北京林业大学
专　业: 森林保护
关键词: 黄栌枯萎病大丽轮枝菌活性氧荧光定量PCR
分类号: S763.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

黄栌是著名观赏树种,构成香山红叶的主体景观,对首都的生态经济建设有举足轻重的意义。然而由大丽轮枝菌引起的黄栌枯萎病近年来爆发成灾,严重影响黄栌林健康,成为威胁我国景观建设的重大生物灾害。本文以黄栌盆栽苗为试验材料,通过接种试验、分离培养等基础方法探讨病原菌侵染循环过程,并在黄栌与病原菌互作过程中,测定活性氧含量及相关酶系活性变化,深入研究活性氧在黄栌寄主抗病过程中的作用。此外,借助实时荧光定量PCR技术,使用SYBR Green染料法,针对大丽轮枝菌ITS及β-tubulin基因片段,设计特异性引物,建立黄栌枯萎病的实时定量检测体系,并借助该定量体系,探究黄栌枯萎病不同症状与病原菌数量的关系。主要结果如下：(1)接种方式与病原菌扩展速度及病害严重程度密切相关。蘸根接种寄主发病速度最快,且死亡率最高。灌根接种次之,但发病进程略慢。枝干底端刮伤涂抹可以引起部分植株发生枯萎病症状,但枝干顶端涂抹与叶片接种不能引起病害的发生。病原菌在寄主体内上行侵染。(2)活性氧水平与黄栌-大丽轮枝菌互作过程密切相关。接种病原菌后,寄主活性氧产生速度增加,且在病害后期有明显积累。活性氧清除酶系活性先升后降,在接种后15天达到峰值,与病原菌在寄主体内扩展进程相一致。病害后期活性氧的过量积累,对寄主细胞造成损伤。(3)建立了大丽轮枝菌的定时定量检测体系。在根据大丽轮枝菌ITS区域及β-tubulin片段设计合成4对特异性引物中,以ITS为目的片段的引物VdF1/VdP1具有高特异性,可以用于大丽轮枝菌的定量检测。该定量检测体系扩增效率高达97.05%,具有良好灵敏度,检测下限为2pg/μl-1。对发病植株新萌生的未显示症状的组织及土壤样品均可检测到病原菌的存在,可有效实现对病害的提前预警。(4)病害症状与病原菌数量并不存在简单对应关系。以建立的定量检测体系,确定不同症状寄主组织内病原菌数量,结果表明,黄栌枯萎病叶片常见的黄萎及绿枯两类症状中,病原菌数量并无明显差异。而相较于未显示症状的植物组织,显示症状的植物组织内病原菌数量明显较多,表明症状的显现可能与病原菌数量相关。

全文目录

摘要  3-4
ABSTRACT  4-8
1 引言  8-19
  1.1 黄栌枯萎病的危害及发生  8-11
    1.1.1 病原菌的分类地位及生物学特性  8-9
    1.1.2 黄栌枯萎病的症状  9
    1.1.3 发生特点及侵染规律  9-10
    1.1.4 病害防治研究  10-11
  1.2 寄主植物对大丽轮枝菌抗病机理研究  11-14
    1.2.1 组织结构抗病性  11-12
    1.2.2 生理生化抗病性  12-13
    1.2.3 分子生物抗病性  13-14
  1.3 活性氧与寄主植物抗病性的关系  14-15
    1.3.1 活性氧的产生及清除机制  14
    1.3.2 活性氧在寄主病原菌互作过程中的作用  14-15
  1.4 病害早期诊断及病原菌监测研究  15-17
    1.4.1 症状识别及分离培养  15-16
    1.4.2 土壤微菌核量化监测技术  16
    1.4.3 分子生物学检测  16-17
  1.5 研究意义  17
  1.6 研究内容  17-18
  1.7 技术路线图  18-19
2 材料与方法  19-30
  2.1 黄栌枯萎病传播扩散及病原菌越冬场所研究  19-23
    2.1.1 供试材料  19
    2.1.2 孢子悬浮液制备  19
    2.1.3 接种方法  19-20
    2.1.4 病害观察及病情统计  20-21
    2.1.5 病原菌越冬场所研究  21-23
  2.2 黄栌与轮枝菌互作过程中活性氧及保护酶活性动研究  23-25
    2.2.1 试验材料  23
    2.2.2 接种及取样方法  23
    2.2.3 活性氧及保护酶系活性测定  23-24
    2.2.4 活性氧定位  24-25
    2.2.5 数据统计  25
  2.3 病原菌定量检测研究  25-30
    2.3.1 收集菌株并提取DNA  25-26
    2.3.2 采集待测样品  26-27
    2.3.3 设计引物并验证特异性  27-28
    2.3.4 制备质粒标准品  28-29
    2.3.5 绘制标准曲线及溶解曲线  29
    2.3.6 灵敏度分析  29
    2.3.7 数据统计  29-30
3 结果与分析  30-42
  3.1 接种方式与病害扩展过程  30-31
  3.2 病原菌越冬场所  31-32
  3.3 活性氧在寄主-病原菌互作中的功能分析  32-35
    3.3.1 活性氧进发情况  32-33
    3.3.2 活性氧清除酶系活性变化  33-34
    3.3.3 活性氧的细胞定位  34-35
  3.4 荧光定时定量系统对病原菌的定量检测  35-42
    3.4.1 特异性分析  35-37
    3.4.2 敏感性分析  37-39
    3.4.3 土壤样品中病原菌的检测  39-40
    3.4.4 植物样品中病原菌的检测  40-42
4 结论与讨论  42-47
  4.1 结论  42
    4.1.1 大丽轮枝菌与黄栌的互作过程分析  42
    4.1.2 病原菌的监测预警  42
  4.2 讨论  42-47
    4.2.1 病原菌的侵染传播过程  42-43
    4.2.2 活性氧与病原菌-寄主互作  43-44
    4.2.3 病原菌的定量检测  44-45
    4.2.4 病害症状与病原菌数量  45-47
图版  47-48
参考文献  48-54
个人简介  54-55
导师简介  55-56
获得成果目录  56-57
致谢  57

大丽轮枝菌对黄栌植株的侵染特点及其定量检测研究

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