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盾壳霉草酸脱羧酶基因转化油菜和拟南芥的研究

作　者: 苏锴
导　师: 李国庆
学　校: 华中农业大学
专　业: 植物病理学
关键词: 盾壳霉草酸脱羧酶基因(cmoxdc) 核盘菌草酸转基因抗病性
分类号: S435.654
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

油菜是一种以榨取食用油为目的的十字花科(Cruciferae)芸薹属(Brassica)植物,在世界范围内广泛种植,是我国长江中下游流域广泛栽培的一种油料作物。中国是油菜大国,产量及种植面积均居世界第1位。核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)侵染油菜引起的油菜菌核病是油菜的一种重要病害,会严重影响油菜的产量和品质,造成较大的经济损失。当环境条件适合病害发生时,农事操作及杀菌剂都不能很好的控制病害,而目前还没有选育出对菌核病抗性较好的品种。草酸(oxalic acid, OA)是核盘菌的一个关键性致病因子,而植物抗草酸能力与其抗病性相关。鉴于草酸在核盘菌致病过程中所起的重要作用,因此,将OA降解酶基因引入植物中,可介导植物抵抗核盘菌的侵染。本研究将盾壳霉草酸脱羧酶基因(Coniothyrium minitans oxalate decarboxylase gene, Cmoxdc)分别转化到油菜及拟南芥中,探讨其对核盘菌侵染的抑制效果,取得了以下研究结果：(1)将盾壳霉草酸脱羧酶(cmoxdc)基因连接在启动子和终止子之间,使其能在植物中表达,成功构建了pCAMBIA1303-oxdc表达载体。(2)测定了拟南芥种子对潮霉素的敏感性,试验结果表明浓度为50mg/L的潮霉素是拟南芥抗性筛选的适宜浓度。(3)完成了拟南芥的遗传转化,获得了200多个转基因拟南芥单株。收集拟南芥T0代种子,通过潮霉素抗性平板筛选得到156株具有潮霉素抗性的拟南芥植株,对这些植株进行PCR检测,得到了9株阳性转基因拟南芥植株。测序结果表明：cmoxdc基因成功插入到这9株拟南芥基因组中。(4)探索了适合农杆菌EHA105菌株转化甘蓝型油菜的适宜条件及组培条件,发现适宜筛选转基因油菜的潮霉素筛选浓度为12.5mg/L,农杆菌侵染油菜的较适宜的浓度为OD600=0.08～0.2,侵染时间15min～30min。(5)完成了约5万个油菜外植体的组织培养,得到约300株油菜再生苗,通过PCR检测,得到7株阳性油菜植株,测序结果表明cmoxdc基因成功插入到这7株油菜基因组中。(6)测定了转基因植株对草酸的耐受性和对核盘菌的抗病性,发现转入cmoxdc的植株对草酸和核盘菌侵染均有一定的耐受性。统计结果表明阳性转化子对草酸毒素或者核盘菌均有一定的抗性或者能延迟发病症状的发生,与野生型之间有极显著差异(P＜0.01), RT-PCR的结果表明：cmoxdc基因在转化子植株中有表达,也说明转入的cmoxdc起到了提高油菜和拟南芥对草酸及核盘菌抗性的作用。

全文目录

摘要  8-10
Abstract  10-12
第一章文献综述  12-25
  1. 油菜菌核病及核盘菌  12-15
    1.1 菌核病对油菜的危害  12
    1.2 核盘菌概况  12-15
      1.2.1 核盘菌概述  12-13
      1.2.2 核盘菌的寄主范围及导致的病害症状  13-14
      1.2.3 核盘菌的生物学特性及生活史  14-15
  2. 核盘菌致病机理研究  15-18
    2.1 细胞壁降解酶  15-16
    2.2 草酸毒素  16-18
  3. 草酸的降解机制及其应用  18-22
    3.1 草酸氧化酶  18-19
    3.2 草酰辅酶A脱羧酶  19
    3.3 草酸脱羧酶  19-22
  4. 转基因技术及其在抗病育种中的应用  22-24
  5. 本研究的目的和意义  24-25
第二章表达载体及农杆菌转化体系构建  25-36
  1 材料与方法  25-33
    1.1 材料  25-26
      1.1.1 菌株、质粒和cDNA  25
      1.1.2 试剂及培养基的配制  25-26
      1.1.3 抗生素  26
      1.1.4 引物  26
    1.2 试验方法  26-33
      1.2.1 扩增目的基因  26-27
      1.2.2 目的片段的回收与连接  27-28
      1.2.3 连接产物的转化  28-29
      1.2.4 阳性克隆的检测与测序  29
      1.2.5 质粒提取  29-30
      1.2.6 双酶切及连接  30-32
      1.2.7 表达载体的检测和保存  32
      1.2.8 农杆菌的热击转化  32-33
  2. 结果与分析  33-34
    2.1 中间质粒pMD18-oxdc的构建  33
    2.2 双酶切  33-34
    2.3 表达载体pCAMBIA1303-oxdc的构建  34
  3. 讨论  34-36
第三章 cmoxdc转化拟南芥的研究  36-43
  1. 材料与方法  36-41
    1.1 材料  36-38
      1.1.1 植株、菌株和载体  36
      1.1.2 试剂及培养基  36-38
    1.2 试验方法  38-41
      1.2.1 拟南芥的种植  38
      1.2.2 拟南芥的潮霉素敏感性测试  38
      1.2.3 农杆菌介导的花序浸染法转化拟南芥  38-39
      1.2.4 潮霉素筛选T_1代种子  39-40
      1.2.5 T_1代抗性植株的PCR检测  40
      1.2.6 T_2代植株的种植与PCR检测  40-41
  2. 结果与分析  41-42
    2.1 HYG梯度浓度筛选  41
    2.2 拟南芥阳性转化子的获得  41-42
  3. 讨论  42-43
第四章 cmoxdc转化油菜的研究  43-49
  1. 材料与方法  43-46
    1.1 材料  43-44
      1.1.1 植株、菌株和载体  43
      1.1.2 试剂及培养基  43-44
    1.2 试验方法  44-46
      1.2.1 油菜下胚轴的遗传转化  44-45
      1.2.2 不同浓度HYG对再生下胚轴的影响  45
      1.2.3 农杆菌侵染浓度和时间的确定  45
      1.2.4 转化子的移栽及抗性鉴定  45-46
  2. 结果与分析  46-47
    2.1 不同浓度HYG对再生下胚轴的影响  46
    2.2 农杆菌侵染浓度和时间的确定  46-47
    2.3 油菜阳性转化子的获得  47
  3. 讨论  47-49
第五章抗病性测定及cmoxdc基因的表达  49-57
  1. 材料与方法  49-52
    1.1 材料  49
      1.1.1 植株和菌株  49
      1.1.2 试剂及培养基  49
    1.2 试验方法  49-52
      1.2.1 转化子对草酸的耐受性  49
      1.2.2 转化子对核盘菌侵染的抗性测定  49-50
      1.2.3 oxdc基因的表达情况  50-52
  2. 结果与分析  52-56
    2.1 阳性转化子的RT-PCR  52-53
    2.2 拟南芥对草酸和核盘菌的抗性  53-54
    2.3 油菜对草酸和核盘菌的抗性  54-56
  3. 讨论  56-57
第六章全文总结及展望  57-58
  1. 研究结果总结  57
  2. 展望  57-58
参考文献  58-68
附录  68-70
致谢  70

盾壳霉草酸脱羧酶基因转化油菜和拟南芥的研究

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