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大豆对疫病的抗性评价、抗病基因挖掘及候选基因分析

作　者: 张吉清
导　师: 朱振东
学　校: 中国农业科学院
专　业: 植物病理学
关键词: 大豆 大豆疫病 抗性分析 抗大豆疫病基因 候选基因
分类号: S435.651
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


由大豆疫霉（Phytophthora sojae Kaufmann&Gerdermann）引起的大豆疫病（Phytophthora rootrot，PRR）是毁灭性大豆病害之一，严重影响大豆产量和品质。因此，发掘和作图大豆抗疫病新基因对防治该病害和抗病育种具有重要的意义。本研究通过接种不同毒力的大豆疫霉菌株对34个大豆品种（系）可能携带的抗病基因分析，利用与Rps1座位连锁的分子标记进行标记基因鉴定，并利用TRAP标记分析了这些品种（系）的多样性；作图和精细定位了2个广谱抗性大豆品种豫豆29和皖豆15抗疫病基因。主要结果如下：1.利用下胚轴创伤接种法鉴定了30个豫豆系列品种（系）及其4个原始亲本对26个不同毒力的大豆疫霉菌株的抗性，应用基因对基因理论对品种（系）进行了抗疫病基因推导。结果表明，34个大豆品种（系）分别抗3个或3个以上大豆疫霉菌株，并产生34种不同的反应型。通过与一套含有单个已知抗病基因大豆品种（系）反应型比较发现，品种周豆17的反应型与含有Rps5品系L85–3059的反应型一致，可能携带抗病基因Rps5；郑77249可能携带抗病基因Rps3a或Rps3a+5抗病基因组合。其它32个大豆品种（系）反应型与已知的抗病基因或抗病基因组合反应型不同。因此，推测这32个大豆品种（系）可能携带新的抗病基因或抗病基因组合。聚类分析表明，当相似系数为0.65时，34个大豆品种（系）、17个鉴别寄主和感病品种Williams共聚为10组。本研究结果表明，河南地区培育的豫豆系列品种（系）对大豆疫霉的抗性具有极其丰富的多样性。这些具有广谱抗性的大豆品种（系）为有效地控制大豆疫病提供了新的抗源。2.利用靶位区域扩增多态性（Target Region Amplified Polymorphism, TRAP）标记对34个品种（系）、17个鉴别寄主和感病品种Williams的遗传多样性进行了分析。32对TRAP标记扩增34个品种（系）共产生251个位点，平均每对引物产生7.84个位点，每个位点均具有多态性，多态性位点比例占100%。基于TRAP标记分析，这34个品种（系）间的遗传相似性位于0.20-0.94，平均相似性为0.57。UPGMA聚类分析，在相似系数为0.57时，52个大豆品种（系）分为9个组。通过与抗性鉴定聚类结果分析表明，大豆对疫病的抗性与TRAP标记聚类结果无关。3.豫豆29是一个对大豆疫霉具有广谱抗性的大豆品种。接种25个不同毒力的大豆疫霉菌株进行抗性分析表明，豫豆29产生的反应型不同于携带已知单个抗病基因的鉴别寄主的反应型。以豫豆29为父本，感病品种吉科豆2号为母本，杂交产生的214个F2:3家系作为作图群体对豫豆29进行抗大豆疫病基因分析。抗性遗传分析表明，F2:3群体中纯合抗病、杂合和纯合感病家系分离比符合1：2：1的分离比，表明豫豆29对大豆疫霉的抗性由一个显性单基因控制，暂时命名为RpsYD29。利用SSR标记，基因RpsYD29被定位在了大豆基因组第3号染色体上（Molecularlinkage group N, MLG N），位于引物SattWM82–50和Satt1k4b之间，与两个标记的遗传距离分别为0.5和0.2cM。对定位区域内的基因序列分析表明，具有NBS-LRR结构的基因Glyma03g04030.1和Glyma03g04080.1可能是RpsYD29基因的参照候选基因。经候选基因克隆测序和序列分析表明，豫豆29和吉科豆2号的两个候选基因在核苷酸和编码的预测氨基酸序列上均存在差异。这些差异可能是造成豫豆29和吉科豆2号抗、感差异的原因。根据抗性鉴定和分子鉴定结果，可知RpsYD29基因可能是Rps1座位上一个新的等位基因或与Rps1座位紧密连锁的基因。4.利用与Rps1座位紧密连锁的分子标记Satt530和Sat186，和与RpsYD29基因紧密连锁的分子标记SattWM82–50和Satt1k4b，对34份大豆品种（系）进行了分子标记基因型分析。发现这4对引物共产生31种标记基因型。这34份大豆品种（系）在这4个位点具有丰富多样性。分子标记基因型分析表明，豫豆23、豫豆24和周豆11可能携带RpsYD25基因；郑77249、郑84285、郑120、郑90007和郑92116可能携带RpsYD29基因；豫豆12、豫豆22和赤黄豆可能携带Rps1a/1d基因；豫豆15可能携带Rps1b基因；齐黄1号、郑7104、山东四角齐、郑135、豫豆13和郑85558可能携带Rps1c/1k基因。5.以大豆品种皖豆15为父本，感病品种Williams为母本杂交产生的102个F2:3家系作为作图群体对皖豆15的抗大豆疫病基因进行分析。抗性遗传分析表明，F2:3群体中纯合抗病、杂合和纯合感病家系分离比符合1：2：1的分离比，表明皖豆15对大豆疫霉菌株PsMC1的抗性由一个显性单基因控制。连锁分析表明，皖豆15携带的抗病基因被定位在了大豆第17号染色体上（MLGD2），位于引物Sattwd15–24/25和Sattwd15–47之间，与这两个引物之间的遗传距离分别为0.5和0.8cM。同时还获得与抗病基因共分离的两对引物Sattwd15–28和Sattwd15–32。这是首次在该染色体上发现和定位的大豆抗病基因，因此将该基因命名为Rps10。对定位区域内的基因序列分析表明，具有丝氨酸/苏氨酸（Ser/Thr）蛋白激酶结构的基因Gly17g28950.1和Gly17g28970.1可能是Rps10的参照候选基因。经侯选基因克隆测序分析，皖豆15和Williams的两个候选基因在核苷酸和编码的氨基酸序列上均存在差异。这些差异可能是造成皖豆15和Williams对大豆疫霉菌株抗、感差异的原因。

全文目录


摘要  6-8
Abstract  8-15
第一章 绪论  15-30
  1.1 大豆疫霉研究进展  15-17
    1.1.1 大豆疫霉生物学特性  15-16
    1.1.2 大豆疫霉种群毒力变异研究  16-17
  1.2 大豆疫病概况  17-19
    1.2.1 大豆疫病的发生与危害  17-18
    1.2.2 大豆疫病危害症状  18
    1.2.3 大豆疫病发病规律  18
    1.2.4 大豆疫病发病条件  18
    1.2.5 大豆疫病的防治对策  18-19
  1.3 大豆疫病抗性资源鉴定  19-20
    1.3.1 大豆疫病抗性资源鉴定方法  19-20
    1.3.2 大豆抗疫病资源筛选  20
  1.4 植物抗病基因研究  20-23
    1.4.1 植物抗病基因类型  20-22
    1.4.2 植物类受体蛋白激酶  22-23
  1.5 大豆抗疫病基因研究  23-27
    1.5.1 大豆抗疫病基因定位  23-25
    1.5.2 我国大豆抗疫霉根腐病基因的多样性  25-26
    1.5.3 大豆抗疫病基因的利用  26-27
    1.5.4 大豆抗疫病基因的结构特征  27
  1.6 本研究的目的意义和技术路线  27-30
    1.6.1 研究目的和意义  27-28
    1.6.2 技术路线  28-30
第二章 主要豫豆系列品种（系）对大豆疫病抗性分析  30-41
  2.1 材料与方法  30-33
    2.1.1 试验材料  30-32
    2.1.2 试验菌株  32
    2.1.3 试验设计  32
    2.1.4 抗性鉴定、抗性评价标准及基因推导  32
    2.1.5 数据分析  32-33
  2.2 结果与分析  33-38
    2.2.1 抗性鉴定  33
    2.2.2 抗病基因推导  33-37
    2.2.3 大豆品种（系）抗性聚类分析  37-38
  2.3 讨论  38-41
第三章 利用 TRAP 标记分析豫豆系列品种（系）多样性  41-48
  3.1 材料与方法  41-42
    3.1.1 试验材料  41
    3.1.2 大豆基因组 DNA 提取  41
    3.1.3 TRAP 标记分析  41-42
    3.1.4 数据统计与分析  42
  3.2 结果与分析  42-45
    3.2.1 TRAP 标记分析  42-44
    3.2.2 遗传聚类分析  44-45
  3.3 讨论  45-48
第四章 豫豆 29 抗疫病基因鉴定与精细定位  48-62
  4.1 材料与方法  48-51
    4.1.1 试验材料  48
    4.1.2 试验菌株及接种体的制备  48-49
    4.1.3 试验设计  49
    4.1.4 抗性鉴定、抗性评价标准  49-50
    4.1.5 大豆基因组 DNA 提取和抗感池构建  50
    4.1.6 SSR 标记开发与筛选  50
    4.1.7 数据分析和连锁图谱构建  50-51
    4.1.8 候选基因克隆与测序  51
  4.2 结果与分析  51-60
    4.2.1 豫豆 29 对 25 个大豆疫霉菌株抗性分析  51-52
    4.2.2 吉科豆 2 号×豫豆 29 杂交组合衍生的 F2:3群体的抗性遗传分析  52-53
    4.2.3 RpsYD29 基因的遗传连锁图谱的构建  53-56
    4.2.4 RpsYD29 候选基因预测  56-57
    4.2.5 RpsYD29 候选基因序列和结构分析  57-59
    4.2.6 候选基因 RpsYD29 在吉科豆 2 号中等位基因分析  59-60
  4.3 讨论  60-62
第五章 豫豆系列品种（系）抗大豆疫病基因分子鉴定  62-67
  5.1 材料与方法  62-63
    5.1.1 大豆材料  62
    5.1.2 大豆基因组 DNA 提取  62
    5.1.3 大豆资源 Rps1 座位和 RpsYD29 座位等位基因的分子检测  62-63
    5.1.4 PCR 扩增与检测  63
  5.2 结果与分析  63-65
  5.3 讨论  65-67
第六章 皖豆 15 对大豆疫病抗性分析  67-79
  6.1 试验材料与方法  67-68
    6.1.1 试验材料  67
    6.1.2 试验菌株及接种体的制备  67
    6.1.3 试验设计  67
    6.1.4 抗性鉴定、抗性评价标准  67-68
    6.1.5 大豆基因组 DNA 提取和抗感池构建  68
    6.1.6 SSR 标记开发与多态性 SSR 标记的筛选  68
    6.1.7 数据分析与连锁图构建  68
    6.1.8 候选基因克隆及序列分析  68
  6.2 结果与分析  68-77
    6.2.1 作图群体表型分析  68-69
    6.2.2 与皖豆 15 抗病基因连锁的 SSR 标记鉴定及分子作图  69-73
    6.2.3 Rps10 候选基因预测  73-74
    6.2.4 Rps10 候选基因序列和结构分析  74-76
    6.2.5 Rps10 候选基因在 Williams 中等位基因分析  76-77
  6.3 讨论  77-79
第七章 全文结论  79-80
参考文献  80-93
附录  93-98
致谢  98-99
作者简历  99

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中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 病虫害及其防治 > 农作物病虫害及其防治 > 经济作物病虫害 > 油料作物病虫害 > 大豆病虫害
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