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烟田土壤青枯菌的分子检测技术及应用

作　者: 种斌
导　师: 蒋士君
学　校: 河南农业大学
专　业: 植物病理学
关键词: 土壤烟草青枯病菌基于PCR的检测病害风险评价
分类号: S435.72
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

烟草青枯病(Tobacco bacterial wilt disease)是由茄劳尔氏菌(Ralstonia solanacearum E.F.Smith)引起的一种广泛分布于世界热带、亚热带和一些温暖地区严重危害世界烟草生产的毁灭性细菌病害,特别是对连作烟草的危害更为严重,常常对烟草生产造成巨大的经济损失。Ralstonia solanacearum随植株病残体遗落于土壤中成为植物青枯病的主要侵染源,主要从根部侵入,定殖于维管束内。田间的青枯病往往能够在高温高湿条件下迅速爆发成灾,烟株表现整株性枯萎、死亡以及根茎系统的坏死。由于目前缺乏高抗青枯病的品种以及效果显著的药物,对青枯病的防治主要依靠农业防治和综合防治,而且烟草青枯病的一旦发病则很难治理,因此能够快速、准确地检测田间土壤中Ralstonia solanacearum的数量则能够为该病的测报、防治设计、防治效果的评价以及品种抗性评价提供重要的科学依据。传统上烟草青枯病菌的检测方法在一定程度上存在着检测周期长、操作复杂、灵敏度不高的缺点,不能很好的满足检测工作的要求。随着分子生物学技术的发展,聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)因其具有快速、特异、灵敏的特点已被广泛应用于病原微生物的检测。本研究旨在运用PCR技术,建立土壤中Ralstonia solanacearum的分子检测体系,并初步应用于检测连作烟田土壤青枯菌的越冬基数、烟草生长季节青枯菌的早期侵染情况、不同地块青枯病流行风险分析、不同防治措施的防病效果评价等方面。主要研究结果如下:1.采用常规的细菌学方法分离鉴定了连作烟田土壤中的青枯菌。2.筛选了青枯菌的PCR检测引物,并据此建立了灵敏特异的植物青枯病菌PCR检测体系。研究结果表明,基于青枯菌16SrDNA ITS保守序列的引物对RaITS-1/2,以及基于青枯菌致病性相关基因的特异性引物对Ralflic-F/R,具有灵敏稳定的检测效果。利用优化的青枯菌PCR检测体系,两对引物对的PCR扩增产物大小分别为145bp、724bp,完全符合预期大小。该检测体系特异性强、灵敏度高,检测灵敏度可以达到10 fg DNA/μl,相当于100cfu/mL,适于土壤及其它材料中的Ralstonia solanacearum检测。3.比较了6种提取土壤总DNA的方法,并探索出了一种制备高质量土壤总DNA的方法,有效解决了土壤腐殖酸、腐殖酸样物、酚类化合物、重金属、不明沉淀物、菌体裂解成分和RNA等抑制后续PCR反应的技术性问题。4.构建了土壤青枯菌半定量检测的分子检测体系。对来自田间土壤样品进行了实际检测结果证明了该分子检测体系是稳定可靠的。对来自重庆黔江新华乡的54个田间土壤样品检测结果与田间发病情况基本一致。首次运用该技术还分析评价了连作烟田Ralstonia solanacearum的越冬预警、早期侵染诊断以及农业防治措施的防病效果。

全文目录

致谢  4-9
摘要  9-10
1 文献综述  10-24
  1.1 烟草青枯菌研究概况  10-16
    1.1.1 烟草青枯病的发生、分布与危害  10
    1.1.2 烟草青枯菌的分类地位  10-11
    1.1.3 青枯菌亚群鉴定  11
    1.1.4 病原形态及存活条件  11-12
    1.1.5 寄主范围  12
    1.1.6 危害症状  12
    1.1.7 烟草青枯病的流行规律  12-13
      1.1.7.1 越冬和传播  12
      1.1.7.2 影响病害流行的因素  12-13
    1.1.8 烟草青枯病的致病机制  13
    1.1.9 烟草青枯病的防治研究现状  13-16
      1.1.9.1 抗病育种  13-14
      1.1.9.2 栽培措施防治  14
      1.1.9.3 化学防治  14-15
      1.1.9.4 生物防治  15-16
  1.2 青枯菌的检测方法研究现状  16-19
    1.2.1 常规检测方法  16
    1.2.2 指示植物法  16-17
    1.2.3 血清学方法  17-18
      1.2.3.1 酶联免疫吸附法  17
      1.2.3.2 间接免疫荧光染色法  17-18
    1.2.4 分子生物学方法  18-19
      1.2.4.1 分子杂交检测法  18
      1.2.4.2 PCR 扩增技术  18-19
  1.3 PCR 技术在土壤微生物检测中的应用  19-24
    1.3.1 土壤微生物总DNA 提取方法研究进展  20-23
      1.3.1.1 裂解细胞  20-21
      1.3.1.2 提取核酸  21-22
      1.3.1.3 纯化核酸  22-23
    1.3.2 PCR 技术在土壤病原菌微生物检测中的应用  23-24
2 引言  24-25
3 材料与方法  25-35
  3.1 烟田土壤青枯菌的分离培养与生理生化鉴定  25-26
    3.1.1 材料  25
      3.1.1.1 培养基  25
      3.1.1.2 试验所用试剂  25
      3.1.1.3 供试土样  25
    3.1.2 试验方法  25-26
      3.1.2.1 土壤样品的采集  25
      3.1.2.2 供试菌株的分离与培养  25
      3.1.2.3 细菌形态及培养性状  25-26
      3.1.2.4 鞭毛染色  26
      3.1.2.5 革兰氏测定  26
      3.1.2.6 氧化酶反应  26
      3.1.2.7 致病性测定  26
  3.2 青枯菌 PCR 检测体系  26-29
    3.2.1 材料  26-27
      3.2.1.1 试验所用培养基  26
      3.2.1.2 试验所用缓冲液  26
      3.2.1.3 试验所用主要试剂及主要仪器设备  26
      3.2.1.4 供试菌株  26-27
    3.2.2 试验方法  27-29
      3.2.2.1 模板 DNA 的制备  27
      3.2.2.2 细菌性青枯菌 PCR 检测体系  27-29
  3.3 烟田土壤中烟草青枯菌 PCR 检测体系  29-32
    3.3.1 材料  29
      3.3.1.1 供试土样  29
      3.3.1.2 试验所用的主要试剂  29
      3.3.1.3 试验所用主要仪器  29
    3.3.2 试验方法  29-32
      3.3.2.1 土壤总 DNA 的提取方法  29-31
      3.3.2.2 土壤中烟草青枯菌 PCR 检测体系的优化建立  31-32
       3.3.2.3 土壤中青枯菌 PCR 检测体系实用性检测  32
  3.4 土壤青枯菌分子检测技术的应用研究  32-35
    3.4.1 应用土壤青枯菌的 PCR 检测技术半定量评价土传青枯菌的越冬数量  32-34
      3.4.1.1 供试土样  32-34
      3.4.1.2 土壤中青枯菌越冬数量的分子检测  34
    3.4.2 应用土壤青枯菌的 PCR 检测技术评价烟草青枯菌的早期侵染情况  34
      3.4.2.1 供试土样  34
      3.4.2.2 土壤青枯菌早期侵染的分子检测  34
    3.4.3 应用土壤青枯菌的 PCR 检测技术评价不同防治措施对烟草青枯菌的控制作用  34-35
      3.4.3.1 供试土样  34
      3.4.3.2 不同处理对土壤青枯菌数量的控制作用检测  34-35
4 结果与分析  35-50
  4.1 烟田土壤青枯菌理化鉴定结果  35-37
    4.1.1 细菌形态与培养性状  35
    4.1.2 鞭毛染色  35
    4.1.3 革兰氏测定  35
    4.1.4 氧化酶反应  35-36
    4.1.5 致病性测定  36-37
  4.2 烟草青枯菌 PCR 检测结果  37-41
    4.2.1 引物筛选及特异性检测  37-39
    4.2.2 PCR 扩增条件优化  39
    4.2.3 PCR 灵敏性检测  39-41
  4.3 烟田土壤青枯菌的 PCR 检测技术  41-45
    4.3.1 土壤 DNA 提取方法比较  41
    4.3.2 土壤青枯菌的 PCR 检测条件优化  41-43
    4.3.3 土壤中青枯菌 PCR 检测体系建立  43
    4.3.4 土壤青枯菌检测体系实用性检测  43-45
  4.4 土壤青枯菌分子检测技术的应用研究  45-50
    4.4.1 应用土壤青枯菌的PCR 检测技术半定量评价土传青枯菌的越冬数量  45-46
    4.4.2 应用土壤青枯菌的PCR 检测技术评价烟草青枯菌的早期侵染情况  46-48
    4.4.3 应用土壤青枯菌的 PCR 检测技术评价不同防治措施对烟草青枯菌的控制作用  48-50
5 结论与讨论  50-53
  5.1 结论  50-51
  5.2 讨论  51-53
    5.2.1 引物检测的特异性  51
    5.2.2 不同土壤总DNA 提取方法对检测结果的影响  51
    5.2.3 PCR 检测性能对检测结果的影响  51-52
    5.2.4 PCR 检测假阳性与假阴性的排除与降低  52
    5.2.5 PCR 检测体系的评价  52
    5.2.6 PCR 检测体系应用效果评价  52-53
参考文献  53-63
ABSTRACT  63-64

烟田土壤青枯菌的分子检测技术及应用

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