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CaCO_3对青枯病菌生长的影响及土壤中青枯病菌的定量PCR分析

作　者: 李洪
导　师: 李振轮
学　校: 西南大学
专　业: 微生物学
关键词: 烟草青枯病菌定量分析钙果胶酶多糖
分类号: S435.72
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

烟草青枯病是由青枯菌Ralstonia solanacearum引起的毁灭性土传病害,对烟草质量和产量影响较大,其防治非常困难。因此,本文主要从药敏试验,无机盐碳酸钙及氯化钙对青枯菌的影响和定量检测土壤青枯菌方面进行研究,探讨最佳药效药物,碳酸钙、氯化钙与青枯菌的关系及该菌在土壤中的定量PCR分析,为深入了解青枯菌在土壤中的发生机制及防治提供理论依据。实验结果如下：半选择培养基(PCCG)和聚合酶链式反应(PCR)技术的结合以分离源自四川省达州市白肋烟茎秆中的青枯菌,并对其生化型做出鉴定,结果分离得到23株青枯菌,均为生化III型。然后分别用叶枯唑,乙蒜素,农用硫酸链霉素,石硫合剂,47%聚赖氨酸,99%曲酸处理该病菌,并建立对照,研究烟草青枯病菌对几种杀菌剂的敏感性,筛选出性能优良的适用药剂。结果表明：所分离菌株对乙蒜素,农用硫酸链霉素,叶枯唑敏感,其中乙蒜素效果最好,对烟草青枯病菌有良好的防治效果。实验室通过接种青枯菌于21个含有不同粒径和不同比例碳酸钙的土壤样品及体外研究pH,Ca2+对青枯菌生长的影响,结果表明青枯菌最适生长pH为6.0,当pH超过8时青枯菌几乎不能生长,且Ca2+对青枯菌的生长有一定的抑制作用,抑制率可达到78.17%。碳酸钙与青枯菌生长量密切相关,碳酸钙粒径大小与青枯菌生长量呈正相关,合适粒径的碳酸钙能使土壤pH增加到8.0和提高土壤中交换性钙离子浓度,而pH的增大和钙浓度的增大是抑制青枯菌生长的主要原因,最适碳酸钙粒径应小于1mm。对青枯菌在不同浓度的氯化钙作用下所产果胶酶活性测试,结果表明产胞外果胶酶活性与所加氯化钙浓度成反比。经方差分析,外源钙与青枯菌产胞外果胶酶活性呈显著负相关(F>Fcrit)。对青枯菌在不同浓度的氯化钙作用下所产胞外多糖测试,结果表明氯化钙对青枯菌所产胞外多糖总量和单产量影响甚小。所有处理与对照相比无显著差别。为实现田间土壤烟草青枯菌的早期检测,建立了土壤中烟草青枯病菌的SYBR Green I荧光定量PCR检测方法。以含331bp序列的重组质粒为荧光定量PCR的标准品,构建定量标准曲线,对种植烟草的不同层次土壤检测青枯菌数量。结果表明,青枯菌检测范围在4.16×103一4.16×108copies/μL之间有良好的线性关系,相关系数R2为0.991,扩增效率为110%,且在种植烟草大田中,发病植株根际土壤青枯菌量大于其它土壤层次中的含菌量,轮作玉米土壤中非根际青枯菌量大于根际土壤中菌量。

全文目录

摘要  7-9
Abstract  9-11
第1章文献综述  11-17
  1.1 钙与植物病原菌概述  11
  1.2 钙与植物侵染性病害  11-12
  1.3 钙抵御植物病原菌可能的作用机理  12-17
    1.3.1 物理屏障作用  12-13
    1.3.2 钙信号调节  13-15
    1.3.3 钙与病原菌相互作用  15-17
第2章选题依据与研究方案  17-21
  2.1 选题依据  17-18
  2.2 研究方案  18-19
    2.2.1 研究目标  18
    2.2.2 研究内容  18-19
  2.3 技术路线  19-21
第3章白肋烟青枯菌的分离鉴定及药敏试验  21-27
  3.1 材料与方法  21-22
    3.1.1 样品采集  21
    3.1.2 细菌分离培养  21
    3.1.3 分子生物学鉴定  21
    3.1.4 生化型鉴定  21-22
    3.1.5 药敏试验  22
  3.2 结果  22-25
    3.2.1 细菌分离鉴定结果  22-23
    3.2.2 药敏试验结果  23-25
  3.3 讨论  25-27
    3.3.1 白肋烟青枯菌的分离鉴定  25
    3.3.2 化学药剂对白肋烟青枯菌的抑菌活性  25-27
第4章碳酸钙对青枯菌的影响  27-35
  4.1 材料和方法  27-28
    4.1.1 青枯菌的接种  27
    4.1.2 土壤样品的处理及接种  27
    4.1.3 土壤中青枯菌的鉴定及数量统计  27-28
    4.1.4 土壤PH值和土壤中交换性钙离子的测定  28
    4.1.5 体外pH，氯化钙，氯离子对青枯菌生存的影响  28
  4.2 结果  28-32
    4.2.1 不同粒径和不同浓度碳酸钙对青枯菌群落的影响  28-29
    4.2.2 不同粒径和不同浓度的碳酸钙对土壤pH，交换性Ca~(2+)的影响  29-30
    4.2.3 体外pH对青枯菌生长的影响  30-31
    4.2.4 体外氯化钙浓度对青枯菌生长的影响  31-32
    4.2.5 体外氯化钠对青枯菌生长的影响  32
  4.3 讨论  32-35
第5章钙对青枯菌产蛋白质影响  35-41
  5.1 材料与方法  35-37
    5.1.1 菌种  35
    5.1.2 培养基  35
    5.1.3 试剂与仪器  35
    5.1.4 方法  35-37
  5.2 结果与分析  37-41
    5.2.1 标准曲线及回归方程  37
    5.2.2 不同钙浓度对青枯菌果胶酶活力的影响  37-41
第6章钙对青枯菌产多糖的影响  41-43
  6.1 材料与方法  41-42
    6.1.1 菌种  41
    6.1.2 培养基及试剂  41
    6.1.3 方法  41-42
  6.2 结果  42
    6.2.1 菌株胞外多糖的产量  42
  6.3 讨论  42-43
第7章土壤中烟草青枯菌定量PCR分析  43-53
  7.1 材料与方法  43-45
    7.1.1 材料  43
    7.1.2 方法  43-45
  7.2 结果与分析  45-52
    7.2.1 土壤样品的采集  45-47
    7.2.2 引物特异性，敏感性及重组质粒鉴定  47-48
    7.2.3 标准曲线及熔解曲线  48-49
    7.2.4 土壤中青枯菌的定量检测  49-52
  7.3 讨论  52-53
第8章结论与建议  53-55
  8.1 主要研究结论  53
  8.2 展望  53-55
参考文献  55-63
附录  63-65
致谢  65-67
发表论文及参加课题  67

CaCO_3对青枯病菌生长的影响及土壤中青枯病菌的定量PCR分析

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