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烟草炭疽病菌的分子检测与烟草品种抗病性研究

作　者: 贾玉
导　师: 张广民
学　校: 山东农业大学
专　业: 植物病理学
关键词: 烟草炭疽病病原鉴定 PCR检测抗性
分类号: S435.72
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

烟草是山东省重要的经济作物之一,该病害一直是影响烤烟优质稳产的重要限制因素。烟草炭疽病是烟草的重要的侵染性病害,此病在烟草各生育期皆可发生,但以苗期发生普遍而严重。幼苗叶片病斑密布,严重发病时往往使整片烟苗毁掉。在防治烟草炭疽病方面,目前在生产上主要采用农业防治和药剂防治。缺乏特效的药剂和抗性品种,本研究对山东省主产烟区采集到得烟草炭疽病菌进行了分离鉴定和分子生物学检测,并对17个烟草种质资源进行了烟草炭疽病的抗性鉴定。为烟草炭疽病的诊断和防治提供了理论基础,为抗病育种的了提供科学依据。本研究主要得到以下结果：1.烟草炭疽病的病原鉴定：通过症状观察、病原物的分离、致病性测定、形态学观察和5.8S rDNA-ITS序列分析,我们鉴定出山东主产烟区烟草炭疽病病原菌为毁灭炭疽菌(Colletotrichum destructivum O’Gara)。病原菌菌落为圆形,起初为灰白色,后期颜色稍深,分生孢子盘黑褐色,着生身生孢子梗和刚毛；刚毛很褐色,散生,有分割；分生孢子为长圆筒形两端钝圆,单胞,无色。根据ITS rDNA构筑供试菌株与其他炭疽菌属真系统进化树中与毁灭炭疽菌聚于同一分支。2.建立了一套快速、高效的检测鉴定烟草炭疽病菌的PCR方法。本研究以采自山东烟区的烟草炭疽病菌为目的菌株,提取基因组DNA,设计了一对特异引物Col/Co2用于C. destructivum的分子检测。利用该引物对包括C. destructivum在内的13个烟草病原菌菌株的基因组DNA进行PCR扩增,结果表明：只有C. destructivum能扩增到特异性条带,其它菌株及阴性对照均无扩增产物。对烟草组织和土壤的检测结果也表明,该对引物能特异性的检测到C. destructivumm基因组DNA的存在。该引物对C. destructivum基因组DNA检测的灵敏度为0.01pg/μL。3.对来自田间的土壤样品进行了实际检测,证明了所建立的PCR检测体系是稳定可靠的。分别检测体系对来自山东蒙阴、沂水、莒县等地8个田间土壤样品进行实际检测,结果与田间发病情况基本一致,证明所建立的PCR检测体系是稳定可靠的.4.通过采用不同的接种浓度和接种苗龄等对烟草品种对烟草炭疽病的苗期抗病性进行了测定,对其表现进行比较,筛选出一套适用于烟草苗期的快速准确的抗病性鉴定方法。烟草炭疽病苗期抗病性鉴定,采用1×108cfu/mL的病原菌悬浮液,在苗龄六周期进行喷雾接种,能较好地表现发病情况,接种后第9天调查发病情况,能够反映不同材料对炭疽病的抗病性差异。5.通过17个烟草品种对炭疽病的抗病性鉴定结果表明,不同烟草品种对炭疽病的抗病性有一定的差异。17份材料中没有高抗和免疫品种,41.2%的烟草品种表现中抗,47.1%表现中感,11.7%高感。

全文目录

中文摘要  9-11
Abstract  11-13
1 引言  13-25
  1.1 烟草炭疽病概述  13-17
    1.1.1 烟草炭疽病的发生及危害  13
    1.1.2 症状  13
    1.1.3 病原及生物学特性  13-14
    1.1.4 病害循环  14
    1.1.5 防治措施  14-17
      1.1.5.1 农业防治  14-15
      1.1.5.2 药剂防治  15
      1.1.5.3 病害测报  15
      1.1.5.4 抗病品种的利用  15-16
      1.1.5.5 生态防治  16
      1.1.5.6 生物防治  16-17
  1.2 真菌病害检测技术  17-22
    1.2.1 真菌的形态学鉴定  17
    1.2.2 分子生物学在真菌分类中的应用  17-21
      1.2.2.1 核糖体转录间隔区序列(ITS)的特点  17-18
      1.2.2.2 IST序列在真菌分类鉴定及分子检测中的应用  18-20
      1.2.2.3 PCR引物设计的基本原则和注意事项  20-21
    1.2.3 炭疽菌分子检测中ITS序列的应用  21-22
  1.3 烟草种质资源及抗病性研究  22-24
    1.3.1 烟草种质资源概述  22
    1.3.2 我国烟草种质资源遗传多样性研究现状  22-23
    1.3.3 烟草种质资源抗病性研究进展  23-24
  1.4 本研究的立题依据和目的  24-25
2 材料和方法  25-34
  2.1 材料  25-26
    2.1.1 供试菌株  25
    2.1.2 供试烟草品种  25-26
    2.1.3 供试载体、宿主菌株  26
    2.1.4 主要仪器  26
  2.2 试验方法  26-32
    2.2.1 病原菌的采集与分离  26
    2.2.2 病原菌致病性鉴定  26-27
    2.2.3 病原菌生物学鉴定  27
    2.2.4 基因组DNA的提取  27-28
    2.2.5 5.8S rDNA-ITS区扩增及序列分析  28-31
      2.2.5.1 5.8S rDNA-ITS区扩增  28
      2.2.5.2 PCR产物的纯化与回收  28-29
      2.2.5.3 目的片段的连接  29
      2.2.5.4 转化大肠杆菌感受态细胞DH5α  29-30
      2.2.5.5 质粒的小量提取  30-31
      2.2.5.6 序列测定、拼接及系统分析  31
    2.2.6 特异性引物的设计  31
    2.2.7 引物特异性验证  31
    2.2.8 引物灵敏度的检测  31-32
    2.2.9 土样中病原菌的检测  32
  2.3 接种方法  32-34
    2.3.1 烟苗准备  32
    2.3.2 菌悬液的制备  32
    2.3.3 接种物浓度实验  32
    2.3.4 接种苗龄实验  32
    2.3.5 病情调查时期试验  32
    2.3.6 接种实验  32
    2.3.7 病情调查  32-34
3 结果与分析  34-43
  3.1 病原菌的鉴定  34-36
  3.2 特异性引物的设计  36
  3.3 引物特异性验证  36-37
  3.4 灵敏度检测  37-38
  3.5 土样中病原菌的分子检测  38
  3.6 山东主产烟区土壤样品检测  38
  3.7 不同接种浓度对苗期抗病性的影响  38-39
  3.8 不同苗龄对苗期抗病性的影响  39-40
  3.9 病情调查时期试验对抗病性的影响  40-41
  3.10 苗期抗病性鉴定  41-43
4 结论与讨论  43-45
参考文献  45-51
附录  51-53
致谢  53

烟草炭疽病菌的分子检测与烟草品种抗病性研究

内容摘要

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