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向日葵黑茎病病原菌分离鉴定及快速检测体系的建立

作　者: 宋娜
导　师: 杨家荣; 胡小平
学　校: 西北农林科技大学
专　业: 植物病理学
关键词: 致病性 分离鉴定 特异性引物 rDNA-ITS 向日葵黑茎病
分类号: S435.655
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


向日葵黑茎病菌引起向日葵茎斑、叶斑、叶枯、花盘腐烂、茎折倒伏等症状，造成向日葵严重减产及含油率降低，甚至绝收，是一种毁灭性病害。新疆伊犁河谷地区出现了一种危害严重、扩展迅速的向日葵病害，导致向日葵大面积死亡，造成了严重的损失。我们开展了病原菌分离与鉴定研究，建立了快速的分子检测体系，以期为该病菌的检疫及病害的早期诊断提供技术支持。1.病原菌的分离与鉴定从新疆采集的发病向日葵茎秆、叶片和花盘中，共分离获得20个真菌分离物，经Koch’s准则证明分离物XJ011和XJ111是引起该病害的病原菌。采用真菌ITS通用引物ITS1/ITS4对XJ011和XJ111菌株基因组DNA进行PCR扩增和测序，得到两个菌株的ITS序列长度分别为523bp和525bp，GenBank注册号分别为AB690462和AB690463，与Leptosphaeria lindquistii （无性态： Phoma macdonaldii）菌株ITS序列的相似度为99%-100%。同时以ITS序列为基础构建系统发育树，结果XJ011和XJ111与Leptosphaerialindquistii聚在了一起，得到了100%的支持率。XJ011和XJ111菌株菌丝灰白色，菌落边缘不规则，产生大量散生、聚生、半埋生具乳突的分生孢子器。分生孢子器的孔口溢出橙红色或乳白的的分泌物，分泌物中含有大量的分生孢子。依据形态学特征、序列分析及致病性测定结果，初步鉴定引起新疆伊犁地区向日葵严重病害的病原物为麦氏茎点霉Phoma macdonaldii Boerema。2.向日葵黑茎病菌快速检测体系的建立本实验通过比对向日葵上常见病害病原菌（向日葵菌核病菌、向日葵白粉病菌、向日葵锈病菌、向日葵黄萎病菌、苜蓿黄萎病菌、变黑轮枝菌、向日葵黑斑病菌、Leptosphaeria dryadis、向日葵茎溃疡病菌、向日葵黑茎病菌）rDNA-ITS序列，在P.macdonaldii多态性丰富的区域设计了一对特异性引物320FOR/320REV。该引物能从向日葵上常见病害病原菌、腐生菌及Phoma macdonaldii的近缘种菌株中特异的检测出向日葵黑茎病菌。灵敏度可以达到1fg。

全文目录


摘要  7-8
ABSTRACT  8-12
引言  12-13
第一章 文献综述  13-22
  1.1 向日葵黑茎病菌概述  13-16
    1.1.1 分布和危害  13-14
    1.1.2 危害症状  14
    1.1.3 病害循环  14-15
    1.1.4 研究近况  15-16
  1.2 分子生物学技术在真菌的鉴定及检测中的应用  16-19
    1.2.1 基因转录间隔区（ITS）概述  16-18
    1.2.2 在真菌分类鉴定中的应用  18-19
    1.2.3 在分子检测方面的应用  19
  1.3 研究的目的意义及技术路线  19-22
    1.3.1 研究的目的意义  19-20
    1.3.2 技术路线  20-22
第二章 向日葵黑茎病菌的分离与鉴定  22-32
  2.1 材料  22-23
    2.1.1 样本采集  22-23
    2.1.2 试剂和仪器  23
  2.2 方法  23-25
    2.2.1 病原菌分离与纯化  23-24
    2.2.2 回接与再分离试验  24
    2.2.3 形态学鉴定  24
    2.2.4 DNA 的提取及质量检测  24-25
    2.2.5 菌株 rDNA-ITS 区扩增和测序  25
    2.2.6 序列比对及系统发育树构建  25
  2.3 结果与分析  25-30
    2.3.1 致病菌的分离与回接试验  25-27
    2.3.2 形态学鉴定  27-28
    2.3.3 病原菌的分子生物学鉴定结果  28-29
    2.3.4 序列比对及系统发育树构建  29-30
  2.4 讨论  30-32
第三章 向日葵黑茎病菌的分子检测  32-40
  3.1 材料  32-33
    3.1.1 供试菌株  32-33
    3.1.2 试剂及仪器  33
  3.2 方法  33-34
    3.2.1 特异性引物的设计  33
    3.2.2 基因组 DNA 提取及质量检测  33-34
    3.2.3 供试菌株 rDNA-ITS 区 PCR 扩增  34
    3.2.4 引物特异性的验证  34
    3.2.5 特异性引物灵敏度检测  34
    3.2.6 向日葵组织中黑茎病菌的特异性检测  34
  3.3 向日葵黑茎病菌的快速检测  34-38
    3.3.1 特异性引物序列  34-35
    3.3.2 DNA 质量检测  35
    3.3.3 rDNA-ITS 区扩增  35-36
    3.3.4 引物特异性验证  36-37
    3.3.5 灵敏度检测  37-38
    3.3.6 向日葵组织中黑茎病菌的特异性检测  38
  3.4 讨论  38-40
第四章 结论  40-42
  4.1 结论  40
  4.2 创新点  40-41
  4.3 研究展望  41-42
参考文献  42-46
致谢  46-47
作者简介  47

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中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 病虫害及其防治 > 农作物病虫害及其防治 > 经济作物病虫害 > 油料作物病虫害 > 向日葵病虫害
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