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海南四种植原体病害病原的分子鉴定及长春花相关病害植原体质粒、sec基因分析

作　者: 郑文虎
导　师: 罗大全
学　校: 海南大学
专　业: 分子植物病理学
关键词: 海南 植原体病害 分子鉴定 序列分析
分类号: S432.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


植原体病害是一种世界范围的植物病害,已经对我国经济作物产生重大危害,海南省植物种类资源丰富、温度适宜,所以海南是植原体病害的适发区,部分植原体病害已经严重为害海南的槟榔等产业的发展。本研究鉴定出四种海南新发生植原体病害病原,并分析了病原植原体相关基因的功能。主要结果如下：本研究使用植原体的通用引物对R16mF2/R16mR1和R16F2n/R16R2,对采自海南岛内7个地区的疑似感染植原体的23个样品进行巢式PCR扩增,结果鉴定出海南新发生的四种植原体病害,分别是辣椒小叶病植原体(HoPLL)、胡椒黄化病植原体(PepY)、假花生黄化病植原体(DeHY)和木薯丛枝病植原体(CasWB).其中辣椒小叶病植原体(HoPLL)、木薯丛枝病植原体(CasWB)、假花生黄化病植原体(DeHY)的16S rDNA序列均为1248bp,胡椒黄化病植原体(PepY)的16S rDNA序列为1246bp,G+C含量的范围为46.95%-47.60%,通过对其16S rDNA序列构建进化树及iPhyClassifier分析,确定辣椒小叶病植原体(HoPLL)、木薯丛枝病植原体(CasWB)、假花生黄化病植原体(DeHY)属于16SrII-A亚组、胡椒黄化病植原体(PepY)属于16SrI-B亚组。本研究首次测定了我国长春花小叶病植原体质粒pPLLHn-1的完整DNA序列,全长4102bp(GenBank登录号：JN835187),G+C含量为24.82%,pPLLHn-1编码5个蛋白。使用生物信息学软件分析得出：ORF2、ORF4编码的蛋白分别含有两个个疏水跨膜区,推测这些蛋白定位在细胞膜上；ORF3的信号肽信号值为0.948,ORF3编码的氨基酸序列与洋葱黄化植原体质粒pEcOYW1参与质粒拷贝数控制的蛋白具有97%的同源性,并且根据分泌蛋白的特征分析初步推断ORF3蛋白为分泌蛋白。研究还发现,SSB蛋白比RepA蛋白更为保守；RepA蛋白变异虽然较大,但是却存在极高度保守的功能基序。本研究成功将pPLLHn-1ORF3、pPLLHn-1ORF4基因进行克隆,并构建表达载体PBI121-pPLLHn1ORF3。本研究测定了长春花小叶病植原体secA基因2523bp,编码556个氨基酸；长春花小叶病植原体secY基因1255bp,编码413个氨基酸；长春花黄化病植原体secA基因836bp,编码277个氨基酸；长春花黄化病植原体secY基因1417bp,包含secY-1(?)(?)secY-2基因,分别编码299个氨基酸和104个氨基酸,并且这两个基因为非重叠基因。通过序列同源性比较,结果表明长春花小叶植原体海南株系属于16SrI-B亚组,长春花黄化植原体海南株系属于16SrV组。从亚组的水平上确定了长春花小叶病植原体的分类地位,从组的水平上确定了长春花黄化病植原体的分类地位。用TMPred程序预测长春花小叶病植原体secY蛋白含有9个跨膜区,预测长春花黄化病植原体secY蛋白含有5个跨膜区,推测这些蛋白定位在细胞膜上,进行转运分泌蛋白,进而参与与宿主植物互作。

全文目录


摘要  5-7
Abstract  7-12
1. 序言  12-18
  1.1 植原体病害研究  12-15
    1.1.1 植原体病害的发现及命名  12
    1.1.2 植原体的主要特征  12-13
    1.1.3 植原体病害的传播途径  13
    1.1.4 植原体病害的症状及危害  13
    1.1.5 植原体的分类鉴定依据  13-14
      1.1.5.1 根据生物学特性的分类  13
      1.1.5.2 根据16S rRNA和rp分组  13-14
      1.1.5.3 基于延伸因子tuf基因的分类  14
      1.1.5.4 基于Sec基因的分类  14
    1.1.6 植原体病害的检测方法  14-15
    1.1.7 植原体质粒研究  15
    1.1.8 植原体病害的防治  15
  1.2 长春花相关植原体病害研究进展  15-16
    1.2.1 长春花小叶病研究现状  16
    1.2.2 长春花黄化病研究现状  16
    1.2.3 长春花变叶病研究现状  16
  1.3 本研究的目的和意义  16-18
2. 海南四种植原体病害病原的分子鉴定  18-35
  2.1 材料与方法  18-24
    2.1.1 材料  18-20
      2.1.1.1 样品的采集  18
      2.1.1.2 菌株和质粒  18
      2.1.1.3 生化及分子生物学试剂  18
      2.1.1.4 缓冲液及培养基配方  18-19
      2.1.1.5 主要实验仪器  19-20
    2.1.2 方法  20-24
      2.1.2.1 植物总DNA提取  20-21
      2.1.2.2 植原体16S rDNA基因的PCR扩增  21-22
      2.1.2.3 PCR产物的克隆及测序  22-24
      2.1.2.4 序列分析软件  24
  2.2 结果与分析  24-34
    2.2.1 辣椒小叶病病原分子鉴定  24-25
      2.2.1.1 辣椒小叶病的田间症状表现  24-25
      2.2.1.2 辣椒小叶病的PCR  25
    2.2.2 胡椒黄化病病原分子鉴定  25-27
      2.2.2.1 胡椒黄化病的田间症状表现  25-26
      2.2.2.2 胡椒黄化病的PCR  26-27
    2.2.3 假花生黄化病病原分子鉴定  27-28
      2.2.3.1 假花生黄化病的田间症状表现  27
      2.2.3.2 假花生黄化病的PCR  27-28
    2.2.4 木薯丛枝病病原分子鉴定  28-29
      2.2.4.1 木薯丛枝病的田间表现  28-29
      2.2.4.2 木薯丛枝病PCR  29
    2.2.5 序列分析  29-30
    2.2.6 构建系统进化树  30
    2.2.7 RFLP电子酶切图谱分析  30-34
  2.3 讨论  34-35
3. 植原体质粒DNA克隆及其分子特征  35-54
  3.1 材料与方法  35-39
    3.1.1 材料  35
      3.1.1.1 样品的采集  35
      3.1.1.2 菌株和质粒  35
      3.1.1.3 生化及分子生物学试剂  35
      3.1.1.4 缓冲液及培养基配方  35
      3.1.1.5 主要实验仪器  35
    3.1.2 方法  35-39
      3.1.2.1 植物总DNA提取  35
      3.1.2.2 植原体质粒的第一次PCR扩增  35-36
      3.1.2.3 植原体质粒的第二次PCR扩增  36
      3.1.2.4 PCR产物的克隆及测序  36
      3.1.2.5 序列分析  36-37
      3.1.2.6 pPLLHn-1ORF3基因的克隆  37-38
      3.1.2.7 pPLLHn-1ORF4基因的克隆  38
      3.1.2.8 pPLLHn-1ORF3表达载体的构建及验证  38-39
  3.2 结果与分析  39-52
    3.2.1 pPLLHn-1的克隆  39
    3.2.2 pPLLHn-1的序列特征  39-40
    3.2.3 pPLLHn-1编码的蛋白同源性比较  40-41
    3.2.4 pPLLHn-1编码的蛋白特征预测  41-45
      3.2.4.1 质粒编码蛋白跨膜结构预测  41-42
      3.2.4.2 质粒蛋白亚细胞定位预测  42-45
    3.2.5 质粒DNA全序列的系统进化分析  45
    3.2.6 植原体质粒的变异分析  45-49
      3.2.6.1 质粒数目的变异  45-48
      3.2.6.2 质粒编码的RepA基因的变异分析  48
      3.2.6.3 质粒编码的SSB基因的变异分析  48-49
    3.2.7 pPLLHn-1ORF3基因的克隆  49-50
    3.2.8 pPLLHn-1ORF4基因的克隆  50
    3.2.9 PBI121-pPLLHn1ORF3表达载体的构建及验证  50-52
      3.2.9.1 PBI121-pPLLHn1ORF3表达载体的酶切验证  50-52
      3.2.9.2 PBI121-pPLLHn1ORF3表达载体的PCR验证  52
  3.3 讨论  52-54
4. 植原体secA与secY基因的克隆与分析  54-64
  4.1 材料与方法  54-57
    4.1.1 材料  54
      4.1.1.1 样品的采集  54
      4.1.1.2 菌株和质粒  54
      4.1.1.3 生化及分子生物学试剂  54
      4.1.1.4 缓冲液及培养基配方  54
      4.1.1.5 主要实验仪器  54
    4.1.2 方法  54-57
      4.1.2.1 植物总DNA提取  54
      4.1.2.2 长春花小叶病植原体secY基因的PCR扩增  54-55
      4.1.2.3 长春花小叶病植原体secA基因的PCR扩增  55
      4.1.2.4 长春花黄化病植原体secY基因的PCR扩增  55-56
      4.1.2.5 长春花黄化病植原体secA基因的PCR扩增  56
      4.1.2.6 PCR产物的克隆及测序  56-57
      4.1.2.7 序列分析  57
  4.2 结果与分析  57-63
    4.2.1 长春花小叶病植原体secY基因和secA基因的克隆与序列分析  57-60
      4.2.1.1 长春花小叶病植原体secY基因的克隆与序列分析  57-58
      4.2.1.2 长春花小叶病植原体secA基因的克隆与序列分析  58-59
      4.2.1.3 长春花小叶病植原体secY基因的生物信息学分析  59-60
      4.2.1.4 长春花小叶病植原体secA基因的生物信息学分析  60
    4.2.2 长春花黄化病植原体secY基因和secA基因的克隆与序列分析  60-63
      4.2.2.1 长春花黄化病植原体secY基因的克隆与序列分析  60-61
      4.2.2.2 长春花黄化病植原体secA基因的克隆与序列分析  61-62
      4.2.2.3 长春花黄化病植原体secY基因的生物信息学分析  62
      4.2.2.4 长春花黄化病植原体secA基因的生物信息学分析  62-63
  4.3 讨论  63-64
5. 结论  64-65
致谢  65-66
硕士期间发表的学术论文  66-67
附录一 英文缩略表  67-70
附录二 23个疑似植原体病害样品的症状表现及采集地  70-73
参考文献  73-76

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中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 病虫害及其防治 > 植物病害及其防治 > 侵（传）染性病害
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