学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

卷枝毛霉脂肪酸脱饱和酶的克隆与表达

作　者: 刘小琳
导　师: 黄建忠
学　校: 福建师范大学
专　业: 微生物学
关键词: 卷枝毛霉 △9-脱饱和酶 △12-脱饱和酶 克隆与表达 启动子
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
下　载: 9次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载
 

内容摘要


卷枝毛霉Mucor circinelloides作为一种产油脂丝状真菌,可用于多种不饱和脂肪酸的生产,具有重大的经济价值。为进一步探究卷枝毛霉的代谢途径和分子机理,本课题对Mucor circinelloides EIM-10的Δ12-脱饱和酶和Δ9-脱饱和酶基因进行克隆分析和表达。结果显示,Δ12-脱饱和酶和Δ9-脱饱和酶全长分别为1191bp和1359bp,编码397和453个氨基酸。序列比对显示,与Amylomyces rouxii (GenBank: AY995173.1)和Mucor circinelloides (GenBank:AF533361.1)具有94%的相似性。将Δ12-脂肪酸脱饱和酶基因连接到酵母表达载体pYES2.0,构建重组表达载体pYMCD12,转入酿酒酵母表达,培养过程中添加半乳糖诱导表达。提取总脂肪酸,GC-MS检测分析：在Δ12-脱饱和酶的催化下,pYMD12将内源油酸(C18:1)转化成亚油酸(C18:2),转化效率36.401%。为了提高表达量,本实验继续探究启动子MD6p和GAP对Δ12-脱饱和酶表达效率的影响。从毕赤酵母表达载体pGAPZa中克隆到GAP启动子,将GAP连接到pYMD12载体中,成功构建pYGAPMD12表达载体；用Δ12-脱饱和酶cDNA替换pYMD6pMD6表达载体中的Δ6-脱饱和酶基因,成功构建pYMD6pMD12表达载体。运用醋酸锂转化法将表达载体转化进酿酒酵母营养缺陷型菌株INVScl中,无需半乳糖诱导表达。提取总脂肪酸,GC-MS检测分析：相对pYMD12,pYMD6pMD12转化C18:1的转化率提高了18.432%,而pYGAPMD12转化C18:1的转化率提高了32.771%;另外pYMD6pMD12不将C16:1转化成C16:2,而pYGAPMD12可以转化C16：1,转化效率为32.943%。

全文目录


中文摘要  2-3
Abstract  3-5
中文文摘  5-7
目录  7-12
绪论  12-26
  一、亚油酸  12-15
    1.1 油酸的定义  12
    1.2 油酸的分布  12-13
    1.3 亚油酸的结构  13
    1.4 油酸的理化性质  13
    1.5 油酸的生物合成途径  13-14
    1.6 油酸的功能  14-15
  二、脂肪酸脱饱和酶  15-22
    2.1 脂肪酸脱饱和酶的分类  15-16
    2.2 脂肪酸脱饱和酶的结构  16
    2.3 脂肪酸脱饱和酶分子研究进展  16-17
    2.4 Δ12-脂肪酸脱饱和酶  17-19
    2.5 Δ9-脂肪酸脱饱和酶  19-20
    2.6 Δ6-脂肪酸脱饱和酶  20-21
    2.7 脂肪酸脱饱和酶的应用  21-22
  三、启动子  22-24
    3.1 启动子的定义  22
    3.2 原核启动子  22
    3.3 真核启动子  22-23
    3.4 脂肪酸脱饱和酶启动子  23-24
  四、本研究的目的意义与主要内容  24-26
    4.1 研究目的及意义  24
    4.2 主要内容  24-26
第一章 Δ9-脱饱和酶和Δ12-脱饱和酶基因克隆及分析  26-42
  第一节 材料与方法  26-33
    1 材料  26-27
      1.1 菌株和质粒  26
      1.2 主要试剂及培养基  26-27
      1.3 主要仪器  27
    2 方法  27-33
      2.1 Δ9-脱饱和酶和Δ12-脱饱和酶基因克隆  27-31
        2.1.1 DNA提取  27-28
        2.1.2 PCR扩增  28-29
        2.1.3 PCR产物回收  29-30
        2.1.4 载体的连接  30
        2.1.5 感受态细胞的制备  30
        2.1.6 大肠杆菌转化  30-31
        2.1.7 菌落PCR验证  31
        2.1.8 序列测定与分析  31
      2.2 Δ9-脱饱和酶和Δ12-脱饱和酶cDNA克隆  31-33
        2.2.1 RNA提取  31-32
        2.2.2 反转录  32
        2.2.3 第二链的合成  32-33
        2.2.4 PCR产物回收  33
        2.2.5 载体的连接  33
        2.2.6 大肠杆菌转化  33
        2.2.7 菌落PCR验证  33
        2.2.8 序列测定及分析  33
  第二节 结果与分析  33-40
    3.1 Δ9-脱饱和酶和Δ12-脱饱和酶DNA克隆  33-36
      3.1.1 DNA提取  33
      3.1.2 Δ9-脱饱和酶和Δ12-脱饱和酶克隆  33-34
      3.1.3 菌落PCR验证  34
      3.1.4 Δ9-脱饱和酶和Δ12-脱饱和酶DNA测序结果  34-36
    3.2 Δ9-脱饱和酶和Δ12-脱饱和酶cDNA克隆  36-40
      3.2.1 RNA提取  36-37
      3.2.2 Δ9-脱饱和酶和Δ12-脱饱和酶cDNA扩增  37
      3.2.3 菌落PCR验证  37-38
      3.2.4 Δ9-脱饱和酶和Δ12-脱饱和酶cDNA序列测序结果  38-40
  第三节 小结  40-42
第二章 脱饱和酶基因在酿酒酵母中的表达  42-54
  第一节 材料和方法  42-48
    1 材料  42-43
      1.1 菌株和质粒  42
      1.2 主要培养基及试剂  42-43
      1.3 主要仪器  43
    2 方法  43-48
      2.1 PYMD9和PYMD12质粒的构建  43-45
        2.1.1 cDNA与pYES2.0载体的连接  43-44
        2.1.2 大肠杆菌转化  44
        2.1.3 菌落PCR验证  44
        2.1.4 重组质粒的提取和双酶切验证  44-45
        2.1.5 序列测定与分析  45
      2.2 酿酒酵母工程菌的表达  45-47
        2.2.1 酿酒酵母感受态细胞的制备  45-46
        2.2.2 醋酸锂转化  46
        2.2.3 菌液PCR验证  46
        2.2.4 酿酒酵母工程菌的诱导表达  46-47
      2.3 重组表达产物的GC-MS分析  47-48
  第二节 结果与分析  48-52
    3.1 重组质粒菌落PCR验证  48
    3.2 重组质粒双酶切验证  48-49
    3.3 醋酸铿法转化酿酒酵母  49
    3.4 转化子菌液PCR验证  49-50
    3.5 酿酒酵母工程菌的诱导表达  50-51
    3.6 脂肪酸转换效率  51-52
  第三节 小结  52-54
第三章 启动子MD6p和GAP对Δ12-脱饱和酶表达效率的影响  54-66
  第一节 材料和方法  54-58
    1 材料  54-55
      1.1 菌株和质粒  54
      1.2 主要试剂培养基  54
      1.3 主要仪器  54-55
    2 方法  55-58
      2.1 表达载体pYGAPMD12和pYMD6pMD12的构建  55-58
        2.1.1 表达载体pYGAPMD12的构建  55-57
          2.1.1.1 GAP片段的克隆  56
          2.1.1.2 PCR产物回收  56
          2.1.1.3 表达载体的连接  56-57
          2.1.1.4 大肠杆菌转化  57
          2.1.1.5 菌落PCR验证  57
          2.1.1.6 双酶切验证  57
          2.1.1.7 序列测定  57
        2.1.2 pYMD6pMD12质粒的构建  57-58
          2.1.2.1 Δ12-脱饱和酶cDNA与表达载体的连接  57-58
          2.1.2.2 大肠杆菌转化  58
          2.1.2.3 菌落PCR验证  58
          2.1.2.4 双酶切验证  58
          2.1.2.5 序列测定及分析  58
      2.2 载体pYGAPMD12和pYMD6pMD12的表达  58
  第二节 结果与分析  58-64
    3.1 pYGAPMD12质粒构建  58-60
      3.1.1 GAP片段的克隆  58-59
      3.1.2 菌落PCR验证  59
      3.1.3 双酶切验证  59-60
      3.1.4 GAP序列测定  60
    3.2 pYMD6pMD12质粒的构建  60-61
      3.2.1 Δ12-脱饱和酶cDNA和pYMD12载体双酶切回收  60
      3.2.2 菌落PCR验证  60-61
      3.2.3 双酶切验证  61
    3.3 pYGAPMD12和pYMD6pMD12的表达及产物GC/MS分析  61-64
      3.3.1 醋酸锂法转化酿酒酵母  61-62
      3.3.2 转化子菌液PCR验证  62
      3.3.3 酿酒酵母工程菌的诱导表达  62-63
      3.3.4 脂肪酸转化效率  63-64
  第三节 小结  64-66
第四章 结论  66-68
参考文献  68-76
附录 主要符号对照表  76-78
攻读学位期间承担的科研任务与主要成果  78-80
致谢  80-81

相似论文

  1. 水稻茎叶特异表达基因启动子的筛选及分析,S511
  2. 棉铃虫和烟夜蛾生殖生物学特性比较研究,S433
  3. 棉铃虫NADPH-细胞色素P450还原酶基因的克隆、时空表达及RNA干扰,S435.622.3
  4. α-半乳糖苷酶高产菌株的筛选及其基因的克隆、表达、纯化和性质研究,TQ925
  5. 水稻纹枯病菌三磷酸甘油醛脱氢酶基因的克隆及其遗传转化体系的构建,S435.111.42
  6. Pib结构基因在不同启动子驱动下的稻瘟病抗性,S435.111.41
  7. J亚型禽白血病病毒抗体检测方法的建立及LTR体外启动活性分析,S858.31
  8. 棉铃虫细胞色素P450基因CYP9A17v2启动子活性分析,S435.622
  9. Pib基因启动子3’端缺失体的暗诱导特性分析,S511
  10. 藤稔葡萄花发育相关基因的克隆及表达分析,S663.1
  11. 苹果Flowering locus T (FT)基因及其启动子的克隆及表达分析,S661.1
  12. 蛋白酶体抑制剂硼替佐米对K562细胞中MDR1表达的影响,R733.7
  13. 年龄相关性皮质性白内障波形蛋白基因外显子和启动子的研究,R776.1
  14. 飞蝗谷胱甘肽硫转移酶基因克隆及特性研究,S433.2
  15. 分枝杆菌同源膜锚定表达载体的构建与细胞定位分析,R378
  16. Sp1基因沉默对前列腺癌细胞CD59表达调控的作用研究,R737.25
  17. 重组厌氧芽胞梭菌eglA p-Her2/neu-IL12融合基因穿梭表达载体的构建,R378
  18. hURAT1基因启动子区-87C/T SNP与原发性痛风的关联及功能研究,R589.7
  19. 青岛地区乙肝病毒BCP基因突变与乙肝相关性原发性肝癌的相关性研究,R512.62
  20. 基于表达数据的家蚕启动子鉴定分析,Q75
  21. 里氏木霉中表达质粒的构建及中性纤维素酶基因的表达,TQ925

中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
© 2012 www.xueweilunwen.com