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大黄鱼肝脏表达的抗菌肽2基因的克隆和表达

作　者: 蔡灿
导　师: 薛良义
学　校: 宁波大学
专　业: 海洋生物学
关键词: 大黄鱼 肝脏表达抗菌肽2 基因结构 半定量表达 原核表达
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


抗菌肽是在多种生物细胞中表达的具有抗菌活性的肽类物质的总称，在免疫反应中发挥着非常重要的作用。肝表达抗菌肽2(liver-expressed antimicrobial peptide-2,LEAP-2)分泌到血液中参与血液循环，从而发挥抗菌活性等作用。本实验通过同源克隆法克隆到LEAP-2基因的完整开放阅读框（OpeningReading Frame，ORF）。LEAP-2基因去全长2236bp，推知基因组包含外显子I78bp，内含子I880bp，外显子II179bp，内含子II1044bp，外显子Ⅲ55bp，编码序列312bp，编码103个氨基酸。这是目前国内关于大黄鱼LEAP-2的首次报道。大黄鱼LEAP-2的ORF推测的LEAP-2蛋白序列编码103个氨基酸，在1-29位氨基酸残基间存在一个潜在的信号肽序列，51-93位氨基酸残基间含LEAP-2superfamily domain，其中在LEAP-2superfamily domain的C末端含有4个保守的Cys残基，形成两对二硫键，呈现出典型的LEAP-2超家族成员的特点，符合肝脏表达的抗菌肽2的结构特征。LEAP-2基因在进化上较保守，大黄鱼LEAP-2氨基酸序列与牙鲆、黄颡鱼、蓝色鲶鱼等鱼类之间的同源性均在95℅以上。系统进化树分析表明，LEAP-2的物种进化关系与目前接受的物种分类关系基本一致，大黄鱼LEAP-2位于鱼类LEAP-2簇中，与牙鲆LEAP-2的亲缘关系最近，达99%。用常规RT-PCR检测LEAP-2在三种不同情况下的大黄鱼成体的9个组织（鳃，肾，脾，心，肌肉，脑，眼，肝，肠）中的半定量表达情况。在检测的正常的9种组织中，大黄鱼LEAP-2肝中表达量最大，在肠中也有表达，眼，脑，肌肉，鳃、心、肾、脾几乎不表达。受恶臭假单胞菌（Pseudomonnas putida）感染大黄鱼48小时和七天后再分别取其9种组织，检测的各组织表达量均明显高于正常条件下的大黄鱼，且大黄鱼肝脏组织LEAP-2mRNA水平在3种条件下都是最高的。与正常组相比，感染48h后肝脏、肾、脾和肠等免疫器官组织LEAP-2表达量显著增加并趋于最大，比其他组织表达量大且表达迅速。因此LEAP-2基因在大黄鱼成鱼的不同组织中表达，表达水平存在显著差异，并且在抗外界病原物感染过程中起重要作用通过对大黄鱼LEAP-2全长cDNA添加BamH Ⅰ和Hind Ⅲ酶切位点和对pET-32a（+）进行双酶切处理，构建pET-32a-LEAP-2重组表达质粒，将其转化到大肠杆菌BL21上并用1.0mmol/L IPTG诱导表达，LEAP-2全长表达的蛋白大小约为27kDa。

全文目录


论文摘要  4-5
Abstract  5-10
引言  10-12
1 综述  12-17
  1.1 水产动物抗菌肽的研究  12-13
  1.2 LEAP-2 的基因的发现  13
  1.3 LEAP-2 的结构  13-14
  1.4 LEAP-2 的基因的组织特异性表达  14
  1.5 LEAF-2 基因的作用机制  14-16
    1.5.1 LEAF-2 基因抗菌机制  14-15
    1.5.2 LEAF-2 基因的信号传导途径  15-16
  1.6 讨论  16-17
2 大黄鱼 LEAP-2 基因分子特征  17-43
  2.1 实验材料  17-21
    2.1.1 样品采集  17
    2.1.2 主要试剂  17-20
    2.1.3 主要耗材  20
    2.1.4 主要仪器  20-21
  2.2 实验方法  21-29
    2.2.1 克隆大黄鱼 LEAP-2 基因 DNA 序列  22-26
    2.2.2 大黄鱼 LEAP-2 cDNA 序列克隆  26-29
  2.3 结果与分析  29-41
    2.3.1 基因组 DNA 提取  29-30
    2.3.2 总 RNA 提取  30-31
    2.3.3 大黄鱼 LEAP-2 基因 DNA 序列克隆  31
    2.3.4 RT-PCR 扩增 LEAP-2 完整开放阅读框  31-32
    2.3.5 大黄鱼 LEAP-2 基因 DNA 序列分析  32-34
    2.3.6 大黄鱼 LEAP-2 cDNA 序列分析  34-41
  2.4 讨论  41-43
3 常规 RT-PCR 检测大黄鱼 LEAP-2 基因的半定量表达  43-52
  3.1 实验材料  43
    3.1.1 样品采集  43
    3.1.2 主要试剂  43
    3.1.3 主要耗材  43
    3.1.4 主要仪器  43
  3.2 实验方法  43-44
    3.2.1 各组织总 RNA 的提取、DNase I 处理及总 RNA 的检测  43
    3.2.2 cDNA 第一链合成  43-44
    3.2.3 β-actin、LEAP-2 特异性引物设计  44
    3.2.4 β-actin 和 LEAP-2 的 PCR 扩增和检测  44
  3.3 结果与分析  44-50
    3.3.1 提取总 RNA 质量的测定  44-47
    3.3.2 LEAP-2 在大黄鱼成体正常组织中的表达情况  47-48
    3.3.3 LEAP-2 在诱导 48 小时后的大黄鱼感染组织中的表达情况  48
    3.3.4 LEAP-2 在诱导 7 天后的大黄鱼感染组织中的表达情况  48-49
    3.3.5 大黄鱼 LEAP-2 在正常和病原菌刺激不同时间后的表达比较  49-50
  3.4 讨论  50-52
4 大黄鱼 LEAP-2 全长基因的原核表达  52-65
  4.1 实验材料  52-54
    4.1.1 样品采集  52
    4.1.2 主要试剂  52-54
    4.1.3 主要耗材  54
    4.1.4 主要仪器  54
  4.2 实验材料  54-60
    4.2.1 大黄鱼 LEAP-2 基因 cDNA 的合成  54-55
    4.2.2 大黄鱼目的片段的扩增  55-56
    4.2.3 重组质粒的构建  56-58
    4.2.4 SDS-PAGE 电泳  58-60
  4.3 结果与分析  60-63
    4.3.1 总 RNA 提取  60
    4.3.2 PCR 产物  60-61
    4.3.3 目的片段克隆  61
    4.3.4 酶切  61
    4.3.5 重组质粒的构建  61-62
    4.3.6 SDS-PAGE 电泳  62-63
  4.4 讨论  63-65
5 结论  65-67
参考文献  67-71
在学研究成果  71-72
致谢  72

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
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