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骨髓间充质干细胞治疗再生障碍性贫血的机制研究

作　者: 赵秀娟
导　师: 乔振华
学　校: 山西医科大学
专　业: 血液内科
关键词: 骨髓间充质干细胞再生障碍性贫血治疗细胞培养
分类号: R556.5
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

目的:探讨骨髓间充质干细胞治疗再生障碍性贫血的机制。方法:（1）体外分离培养正常人和再障患者的骨髓问充质干细胞,观察其形态学的差异,同时用流式细胞仪检测其分子表面抗原以及PCR法检测成脂肪细胞的差异。（2）提取56例再障患者的骨髓单个核细胞按发病机制进行分组培养。（3）①用正常骨髓MSC与再障的MNC共孵育,每周计数总细胞数,集簇、集落数,进一步分析增殖动力学。②用正常骨髓MSC与再障的T细胞共孵育,流式细胞仪检测T细胞表面抗原和T亚群的变化,以及与免疫相关的细胞因子IL-2,IL-4,IL-10、IFN-γ、TNF-α、TGF-β六种细胞因子的基因（RT-PCR法）和蛋白（ELISA法）两个水平在共孵育前后表达的变化。（4）正常骨髓MSC输注再生障碍性贫血小鼠模型中,观察其一般状况、骨髓、脾脏病理组织的改变。结果:1、（1）正常组和AA组MSC细胞形态和表面标志无明显差别。（2）体外AAMSC向脂肪细胞诱导分化较正常组早。（3）AA-BMSCs表面有mIL-15的异常表达。2、AA发病机制分组结果属干细胞缺陷组14例（28%）,免疫介导组27例（44.8%）,微环境缺陷组15例（24.1%）。3、正常骨髓MSC能够支持AA红系集落、粒-单系集落、HPP-CFC集落的增殖。4、（1）AA患者外周血Treg细胞数量减少,提示AA属于自身免疫病。（2）AA患者外周血T细胞长期表达CD69,提示AA T细胞处于预激活状态。（3）AA外周血T淋巴细胞与正常骨髓间充质干细胞共培养T细胞的生长曲线以及淋巴细胞增殖率均下降。（4）AA外周血T淋巴细胞与正常骨髓间充质干细胞共培养后,T细胞的表面标志Annexin-V无变化,而CD8表达下降,CD4/CD8回升。（5）骨髓间充质干细胞下调AAIL-2、IFN-γ、TNF-α的表达,同时上调IL-4、IL-10、TGF-β1的表达,从而调节AA紊乱的免疫。5、（1）联合应用3.0GY ⁶⁰Co-γ线照射全身一次照射后,第4d,5d,6d ipCY 50.0 mg/kg和CH 62.5 mg/kg,小鼠外周血HB,WBC,PLT及造血器官病理检查均符合AA标准,模型建立成功。（2）造模后,加用正常骨髓MSC可使WBC,PLT,HB的回升,修复骨髓和脾脏的病理结构,提高造血功能。结论:1、正常组和AA组MSC细胞形态和表面标志无明显差别,但体外AAMSC易成脂性和表面有mIL-15的异常表达可能参与了再生障碍性贫血的发生。2、再生障碍性贫血是一种T细胞异常激活的自身免疫性疾病。3、正常骨髓MSC能够支持从红系集落、粒-单系集落、HPP-CFC集落的增殖。4、正常骨髓间充质干细胞可能通过下调AA IL-2、IFN-γ、TNF-α、CD8的表达,同时上调IL-4、IL-10、TGF-β1、CD4的表达,而调节AA紊乱的免疫。5、正常骨髓MSC输注能改善再障模型小鼠的一般情况,回升外周血象,修复骨髓和脾脏的组织结构,改善造血功能。

全文目录

中文摘要  8-9
英文摘要  9-11
前言  11
研究背景  11-16
第一部分骨髓间充质干细胞支持微环境缺陷型再生障碍性贫血患者的造血机制研究  16-51
  引言  16-17
  实验流程  17-18
  实验一再生障碍性贫血患者骨髓间充质干细胞的生物学特性初步研究  18-23
    材料与方法  18-20
    结果  20-21
    讨论  21-23
  实验二再生障碍性贫血患者发病机制分型  23-27
    材料与方法  23-25
    结果  25
    讨论  25-27
  实验三骨髓间充质干细胞(MSC)支持再障(AA)患名造血细胞增殖的实验研究  27-35
    技术路线  27
    材料和方法  27-29
    结果  29-31
    讨论  31-35
  小结  35
  参考文献  35-39
  本部分附图  39-51
第二部分骨髓间充质干细胞调节再生障碍性贫血患者的免疫实验研究  51-91
  引言  51-52
  实验流程  52-53
  实验一 T淋巴细胞的分离、纯化  53-56
    引言  53
    材料  53
    方法  53-54
    结果  54
    讨论  54-56
  实验二骨髓间充质干细胞对再生障碍性贫血患者T细胞活性以及表面标志的影响  56-62
    仪器、材料和试剂  56-57
    方法  57-59
    结果  59
    讨论  59-62
  实验三骨髓间充质干细胞对再生障碍性贫血患者IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ、TNF-α、TGF-β1的影响  62-74
    前言  62-63
    材料与仪器  63
    方法  63-66
    结果  66-68
    讨论  68-74
  小结  74
  参考文献  74-78
  本部分附图与表  78-91
第三部分骨髓间充质干细胞对再生障碍性贫血动物模型的作用  91-111
  引言  91
  实验流程  91-92
  实验一再生障碍性贫血小鼠模型的制备  92-96
    材料与仪器  92
    方法  92
    结果  92-94
    讨论  94-96
  实验二骨髓间充质干细胞体内支持再障模型造血的试验研究  96-103
    材料  96-97
    方法  97-98
    结果  98-100
    讨论  100-103
  小结  103
  参考文献  103-105
  本课题结论  105-106
  本部分附图  106-111
综述一  111-135
综述二  135-156
个人简历  156-158
致谢  158

骨髓间充质干细胞治疗再生障碍性贫血的机制研究

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