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诱导型一氧化氮合酶对大鼠胰岛存活和功能影响的实验研究

作　者: 李柏峰
导　师: 刘永锋
学　校: 中国医科大学
专　业: 外科学
关键词: 胰岛细胞因子诱导型一氧化氮合酶 RNA干扰氨基胍
分类号: R587.1
类　型: 博士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

前言糖尿病是病人及其家庭的沉重负担,对该病的治疗也是医学界长久以来的一个难题。约30～50%以上的糖尿病病人会出现的并发症,进而导致生活质量降低,生存时间缩短,医药费增加。糖尿病病人持续的高血糖是发生并发症的决定性危险因素。目前,保持长期稳定的正常血糖,同时避免低血糖危险的唯一途径,就是替换病人的胰岛:包括带血管的胰腺移植,或者注射纯化的胰岛细胞。在最近的20年,胰腺移植治疗糖尿病效果显著——能够预防和逆转糖尿病并发症,改善生活质量,延长生存时间,而且医疗费用有所减少。胰腺移植的成功提示,在长期的非特异性免疫抑制状态下,胰岛β细胞替代治疗效果确切。胰岛移植属于细胞移植范畴,是侵入性最小的β细胞替代疗法,与胰腺移植相比具有安全、简便、利于体外移植物修饰、不良反应低和可重复性好等优点,短期疗效令人满意,已成为很有发展前景的方法。但是,当前的胰岛移植仍存在供胰需要量大,胰岛移植物代谢活性差,存活率低等问题。因此,胰岛移植的远期疗效仍不乐观。造成这些问题的原因很多。首先,胰岛制备的质量对移植胰岛功能的恢复起到重要影响,在胰岛分离纯化过程中始终要注意保护胰岛的存活和功能。其次,移植后受体自身免疫性疾病复发导致的胰岛死亡,移植物再血管化延迟引起的胰岛持续缺血缺氧,移植物进入体内面临的炎症反应,以及氧化应激反应等,均可引起胰岛移植物的破坏。而且,上述因素不仅可以直接损伤胰岛,还可以活化各种细胞因子,如白细胞介素（IL）-1β、肿瘤坏死因子（TNF）-α、干扰素（IFN）-γ,以及一氧化氮（NO）等,对胰岛移植物产生严重的损害。近年来的研究表明,IL-1β、TNF-α等细胞因子对胰岛的损害主要通过刺激诱导型一氧化氮合酶（inducible NO synthase,iNOS）过度表达来完成的。在这些细胞因子的作用下,胰岛中的β细胞和巨噬细胞可大量表达iNOS,催化生成过量的NO,后者作为效应分子发挥对胰岛β细胞的损害作用。本实验使用RNA干扰和iNOS抑制剂氨基胍,抑制iNOS的表达与活性,观察胰岛的存活和功能,从而明确iNOS/NO对胰岛的损害作用,探索保护胰岛功能的途径。实验方法一、胰岛的分离和纯化普通级封闭群Wistar大鼠,体重200-250g。采用腹腔内注射10%的水合氯醛麻醉,胶原酶V原位灌注,快速切取,水浴消化。消化液呈乳糜状、外观不透明时迅速倒入冷的Hank’s液,加满50ml离心管以终止消化,并且轻轻振荡混匀后低温离心一次。再经80目不锈钢筛网过滤,以去除大快的组织和线结,再次离心。然后采用Ficoll不连续密度梯度离心纯化胰岛。二、胰岛培养及分组胰岛分离纯化后悬浮于RPMI-1640培养基中培养,培养密度为20IEQ/孔,培养条件为:37℃、5%二氧化碳、95%空气。根据实验目的分为空白对照组、RNA干扰组、氨基胍组、细胞因子组、RNA干扰+细胞因子组、氨基胍+细胞因子组。三、转染使用iNOS的siRNA转染培养的胰岛。分别将转染试剂与siRNA用不含血清和抗菌素的培养基稀释后混合,形成siRNA-转染试剂混合液。将siRNA-转染试剂混合液加入含有胰岛的培养基中,在37℃的CO₂培养箱中培养8h后将培养基更换为含有血清和抗菌素的完全培养基,继续培养24、48h。四、RT-PCRRT-PCR检测胰岛组织中iNOS mRNA水平,以反映RNA干扰效果。同时检测凋亡相关基因Bax和Fas的表达,以反映胰岛的凋亡情况。GAPDH作为内参照。五、Western-blotWestern-blot检测iNOS蛋白的表达,检测RNA干扰的效果,β-actin作为内参照。六、检测NO和iNOSNO试剂盒通过硝酸还原酶法检测培养液NO水平,NOS试剂盒检测胰岛组织iNOS活性。七、胰岛活性鉴定胰岛分离纯化培养后,用丫啶橙/溴乙啶（AO/EB）荧光染色观察胰岛活性。将AO/EB与胰岛制备物混合孵育10min,在荧光显微镜下观察。AO对活细胞染色发出绿色荧光,EB对死细胞染色呈桔黄或桔红色荧光。八、胰岛功能检测胰岛素释放实验,胰岛用Kreb’s-Hank’s液（含有10mmol/L的HEPES和0.25%牛血清白蛋白）液洗涤二次,计数10IEQ胰岛。先用含低浓度葡萄糖（2.8mmol/L）的Kreb’s-Hank’s液孵育2h,然后用含有高浓度葡萄糖（16.7mmol/L葡萄糖）的Kreb’s-Hank’s液孵育1h。收集第2h和第3h的培养液并去除附着的细胞和碎片,采用放免法检测培养液中胰岛素含量,计算胰岛素释放指数（Secretion Index,SI）。SI=第3h（高糖环境）的胰岛素含量/第2h（低糖环境）的胰岛素含量。九、统计学分析使用软件SPSS13.0进行统计学分析,所用数据以平均数±标准差表示,P＜0.05为有统计学差异。实验结果一、胰岛获得量、纯度及活性采用名尼苏达大学改良法,平均每只大鼠可获得约500—600IEQ胰岛,STZ染色提示纯度在80%以上,AO/EB荧光染色显示新鲜分离的胰岛存活率＞95%。二、RNA干扰效果在培养的胰岛中加入细胞因子IL-1β和TNF-α后,iNOS-mRNA表达显著增强,而RNA干扰能够抑制这种细胞因子的刺激作用,使iNOS-mRNA表达减弱,并阻止iNOS蛋白产物的合成。上述结果提示,RNA干扰技术可以成功的沉默大鼠胰岛组织的iNOS基因,抑制iNOS蛋白生成。三、胰岛培养液中NO水平及胰岛组织中iNOS活性新分离纯化的胰岛中iNOS活性较低,培养液中NO含量较少;而用细胞因子IL-1β和TNF-α处理胰岛24h后,iNOS和NO水平均明显升高。而当细胞因子和氨基胍共同加入培养基时,胰岛iNOS活性受到显著抑制,NO水平也明显降低。提示氨基胍可以抑制iNOS活性,效果确切。四、胰岛活性AO/EB染色显示,新分离纯化后的胰岛存活率＞95%;而与细胞因子IL-1β和TNF-α共同培养24h后,胰岛大量死亡。当使用RNA干扰或诱导型一氧化氮合酶抑制剂氨基胍,与细胞因子共同作用于胰岛时,AO/EB染色显示胰岛存活情况明显改善。五、胰岛凋亡胰岛经细胞因子IL-1β和TNF-α处理后,促凋亡基因Bax和Fas表达明显升高,提示这两种细胞因子能够诱导胰岛细胞凋亡。而经RNA干扰沉默iNOS基因后,胰岛与细胞因子IL-1β和TNF-α共同培养时,促凋亡基因表达明显下降。六、胰岛功能新分离纯化后的胰岛功能较好,基础胰岛素分泌量和胰岛素释放指数较高;而与细胞因子IL-1β和TNF-α共同培养24h后,胰岛分泌量和释放指数明显下降,提示胰岛功能遭到破坏。使用RNA干扰或氨基胍处理后的胰岛,再同细胞因子共同培养时,胰岛素分泌和释放指数均明显高于细胞因子组,胰岛功能得到保护。结论一.在IL-1β、TNF-α等细胞因子的刺激下,胰岛组织中诱导型一氧化氮合酶（iNOS）可大量表达,催化合成的高浓度NO是β细胞损伤的效应因子。二.使用RNA干扰技术特异性沉默iNOS基因,从mRNA水平证明iNOS/NO介导了细胞因子对胰岛的损害。三.氨基胍减轻细胞因子对胰岛的损害,改善胰岛的存活与功能,是通过抑制胰岛iNOS活性,控制NO过量产生来实现的。

全文目录

一摘要  5-16
  中文论著摘要  5-10
  英文论著摘要  10-16
二、英文缩略语  16-17
三、论文  17-58
  论文一 RNA干扰诱导型一氧化氮合酶基因对大鼠胰岛功能和存活影响的实验研究  17-42
    前言  17-18
    实验方法  18-26
    实验结果(附论文图片)  26-37
    讨论  37-41
    结论  41-42
  论文二诱导型一氧化氮合酶抑制剂对大鼠胰岛保护作用的实验研究  42-58
    前言  42-43
    实验方法  43-45
    实验结果(附论文图片)  45-53
    讨论  53-57
    结论  57-58
四、本研究创新性的自我评价  58-59
五、参考文献  59-71
六、附录  71-93
  1. 综述  71-91
  2. 在学期间科研成绩  91-92
  3. 致谢  92-93
  4. 个人简介  93

诱导型一氧化氮合酶对大鼠胰岛存活和功能影响的实验研究

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