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DSP等赤潮藻毒素对哺乳类细胞的毒性效应及机制研究

作　者: 陈洋
导　师: 周名江；颜天
学　校: 中国科学院研究生院（海洋研究所）
专　业: 海洋生物学
关键词: 大田软海绵酸利玛原甲藻东海原甲藻米氏凯伦藻亚历山大藻哺乳类细胞细胞凋亡
分类号: X55
类　型: 博士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

本文利用四株哺乳类细胞(两株正常细胞:小鼠皮肤细胞JB6-C41和人肝细胞HL-7702;两株肿瘤细胞:人肝癌细胞Bel-7402和小鼠神经瘤细胞Neuro-2a),通过MTT比色法、光学显微镜和电镜观察、Annexin V-FITC&PI双染法、TUNEL法和TBA比色法等方法,研究了腹泻性贝毒的主要组分大田软海绵酸(Okadaic acid, OA)、利玛原甲藻(Prorocentrum lima)、东海原甲藻(Prorocentrum donghaiense)、米氏凯伦藻(Karenia mikimotoi)、相关亚历山大藻(Alexandrium affine)和塔玛亚历山大藻(Alexandrium tamarense, AT-6)的提取物对哺乳类细胞增殖的影响,并就OA、利玛原甲藻脂溶性组分、米氏凯伦藻极性脂类组分对哺乳类细胞形态和结构的影响以及它们和相关亚历山大藻去藻过滤液未知毒性物质诱导细胞凋亡或细胞氧化损伤等致毒机制展开研究。结果显示:OA和利玛原甲藻的脂溶性组分显著抑制小鼠皮肤细胞、人肝细胞、人肝癌细胞和小鼠神经瘤细胞的增殖,且这种抑制作用呈剂量依赖性,其对四株细胞增殖的24h IC50分别为100ng/ml、85 ng/ml、65ng/ml、70ng/ml和6000cells/ml、4000cells/ml、2000cells/ml、1000cells/ml。米氏凯伦藻的极性脂类组分对四株细胞的增殖均有显著的抑制作用,而非极性组分和水溶性组分对四株细胞的增殖无明显的不利影响。相关亚历山大藻的去藻过滤液>5K组分对四株细胞的增殖均有明显的抑制作用,但藻细胞内容物无明显的不利影响。东海原甲藻的脂溶性组分、塔玛亚历山大藻(AT-6)的去藻过滤液和藻细胞内容物对四株细胞的增殖均无明显的抑制作用。这表明:OA和利玛原甲藻、米氏凯伦藻、相关亚历山大藻产生的一些毒性物质能够抑制哺乳类细胞的增殖。OA和利玛原甲藻脂溶性组分能导致四株细胞的形态和超微结构发生明显改变:细胞变圆,细胞膜皱褶、卷曲、发泡,细胞之间相互分离,部分细胞脱壁,可见膜包裹的凋亡小体;细胞表面微绒毛减少或消失,细胞核染色质凝集成团块状或边集,核膜破裂,细胞内容物以发泡的形式排出,细胞质显著空泡化,这些变化符合凋亡细胞的典型特征。Annexin V-FITC & PI双染法及TUNEL法检测也发现:OA、利玛原甲藻脂溶性组分能够诱导四株细胞发生凋亡,这与形态学观察的结果一致。Annexin V-FITC & PI双染法检测还发现:相关亚历山大藻的去藻过滤液>5K组分能够诱导四株哺乳类细胞凋亡。这表明:OA、利玛原甲藻脂溶性组分和相关亚历山大藻未知毒性物质可能通过诱导细胞凋亡而对哺乳类细胞造成影响。米氏凯伦藻极性脂类组分导致四株细胞变圆、脱壁、肿胀,细胞膜破裂,这表明细胞发生坏死而非凋亡,双染法的检测结果也进一步证明了细胞发生坏死。而且,这种未知毒性物质导致四株细胞培养液中丙二醛的含量均明显升高,表明:米氏凯伦藻内的未知毒性物质能够引发细胞脂质过氧化,对细胞造成氧化损伤,这与OA、利玛原甲藻脂溶性组分和相关亚历山大藻未知毒性物质对哺乳类细胞的影响机制明显不同。四株不同类型的哺乳类细胞对毒素或毒性物质的敏感性略有不同,但差异不明显。小鼠神经瘤细胞和人肝癌细胞略敏感,其次分别为人肝细胞和小鼠皮肤细胞。本研究首次将小鼠神经瘤细胞应用于DSP等赤潮藻毒素的毒性检测,发现:该细胞对毒素反应较敏感,检出限与其它化学或生物检测方法的检出限相当;而且,这些细胞毒性检测方法操作简便、快速,样品处理流程简单,所需样品量少,因此,应用该株细胞进行的细胞毒性测试方法具有发展为DSP等赤潮藻毒素毒性检测常规方法的潜能。Neuro-2a细胞既可用于PSP毒素毒性的检测,也可用于DSP等赤潮藻毒素的毒性检测,这将为赤潮藻毒素的快速检测提供便利。综上所述,DSP毒素和我国沿海的重要赤潮原因种(米氏凯伦藻、亚历山大藻等)能够产生毒素或毒性物质,并通过诱导细胞凋亡、引发氧化损伤等方式对哺乳类细胞造成毒性影响,因此,赤潮藻毒素或毒性物质通过食物链的传递进入人体后,有可能危害人类的健康,应引起我们的高度关注。另一方面,由于赤潮藻毒素或毒性物质对肿瘤细胞的抑制活性,其潜在的药用价值值得进一步去探索。

全文目录

中文摘要  8-10
英文摘要  10-13
引言  13-15
第一章文献综述  15-40
  1.1 赤潮及其危害  15-17
    1.1.1 有害赤潮的定义  15
    1.1.2 有害赤潮的危害  15-17
  1.2 我国沿海重要赤潮藻及其毒素或毒性物质  17-22
    1.2.1 腹泻性贝毒毒素及其产毒藻  18-20
    1.2.2 东海原甲藻  20
    1.2.3 米氏凯伦藻  20-21
    1.2.4 相关亚历山大藻  21-22
  1.3 赤潮藻毒素对哺乳类细胞的毒性效应  22-31
    1.3.1 神经性毒素对哺乳类细胞的毒性效应  24-25
    1.3.2 腹泻性贝毒对哺乳类细胞的毒性效应  25-28
    1.3.3 其它藻毒素对哺乳类细胞的毒性效应  28-29
    1.3.4 赤潮藻毒素的生物活性  29-31
  1.4 赤潮藻毒素细胞毒性检测方法  31-40
    1.4.1 神经性毒素的细胞毒性检测方法  31-32
    1.4.2 细胞凋亡的检测方法  32-40
第二章 DSP 等赤潮藻毒素对哺乳类细胞增殖的影响  40-58
  前言  40-41
  2.1 材料与方法  41-44
    2.1.1 实验材料  41-42
    2.1.2 实验方法  42-44
  2.2 实验结果  44-53
    2.2.1 OA 对四株哺乳类细胞增殖的影响  44-45
    2.2.2 利玛原甲藻脂溶性组分对四株哺乳类细胞增殖的影响  45-48
    2.2.3 东海原甲藻脂溶性组分对四株哺乳类细胞增殖的影响  48
    2.2.4 米氏凯伦藻提取物四种组分对四株哺乳类细胞增殖的影响  48-50
    2.2.5 塔玛亚历山大藻（AT-6）提取物四种组分对四株哺乳类细胞增殖的影响  50-51
    2.2.6 相关亚历山大藻(AC-1)和塔玛亚历山大藻（AT-6）各组分对株哺乳类细胞增殖的影响  51-53
  2.3 讨论与小结  53-58
第三章 DSP 等赤潮藻毒素对哺乳类细胞形态和超微结构的影响  58-72
  前言  58
  3.1 材料与方法  58-60
    3.1.1 实验材料  58-59
    3.1.2 实验方法  59-60
  3.2 实验结果  60-69
    3.2.1 OA 对四株哺乳类细胞形态和超微结构的影响  60-66
    3.2.2 利玛原甲藻脂溶性组分对四株哺乳类细胞形态和超微结构的影响  66-68
    3.2.3 米氏凯伦藻极性脂类组分对四株哺乳类细胞形态的影响  68-69
  3.3 讨论与小结  69-72
第四章 DSP 等赤潮藻毒素对哺乳类细胞凋亡的诱导作用  72-85
  前言  72-73
  4.1 材料与方法  73-76
    4.1.1 实验材料  73-74
    4.1.2 实验方法  74-76
  4.2 实验结果  76-81
    4.2.1 OA 对四株哺乳类细胞凋亡的诱导作用  76-78
    4.2.2 利玛原甲藻脂溶性组分对四株哺乳类细胞凋亡的诱导作用  78-80
    4.2.3 相关亚历山大藻未知毒性物质对四株哺乳类细胞凋亡的诱导作用  80
    4.2.4 米氏凯伦藻极性脂类组分对四株哺乳类细胞凋亡的诱导作用  80-81
  4.3 讨论与小结  81-85
第五章米氏凯伦藻未知毒性物质对哺乳类细胞的氧化损伤  85-91
  前言  85-86
  5.1 材料与方法  86-87
    5.1.1 实验材料  86
    5.1.2 实验方法  86-87
    5.1.3 统计分析  87
  5.2 实验结果  87-88
    5.2.1 米氏凯伦藻甲醇/水提取物对四株哺乳类细胞脂质过氧化程度的影响  87-88
    5.2.2 塔玛亚历山大藻（AT-6）甲醇/水提取物对四株哺乳类细胞脂质过氧化程度的影响  88
  5.3 讨论与小结  88-91
第六章全文讨论与结论  91-97
  6.1 全文讨论  91-95
    6.1.1 四株哺乳类细胞敏感性的比较  91
    6.1.2 利用Neuro-2a细胞进行的DSP等赤潮藻毒素细胞毒性检测方法的应用潜能  91-94
    6.1.3 赤潮藻未知毒性物质的危害  94-95
  6.2 结论  95-97
参考文献  97-116
文中图目录  116-119
文中表目录  119-120
附录  120-121
发表和完成文章目录  121-122
致谢  122-123

DSP等赤潮藻毒素对哺乳类细胞的毒性效应及机制研究

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