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Zea mays ssp. mexicana的利用和玉米优异渐渗系的创造及细胞学分析

作　者: 王灵芝
导　师: 张举仁
学　校: 山东大学
专　业: 细胞生物学
关键词: 玉米墨西哥玉米杂交渐渗系基因组原位杂交胚乳蛋白双向凝胶电泳
分类号: S513
类　型: 博士论文
年　份: 2006年
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内容摘要

玉米是重要的粮食兼饲料作物。由于驯化中的“瓶颈效应”和随后的改良选择使得其遗传多样性相对于野生近缘种明显降低,现代玉米育种大多采用少数骨干自交系进行品种改良,导致玉米育种材料的遗传基础狭窄。我国不是玉米原产地,可利用的玉米育种材料相对贫乏,近十余年来未能培育出产量大幅度提高的单交种。没有种质的扩增和创新就没有玉米杂种优势水平的突破,这在玉米育种界中已形成共识。因此,种质的拓宽与创新是玉米育种的战略任务,其中开发和利用野生资源是其重要的途径之一。Zea mays ssp.mexicana是玉米近缘野生材料,与普通玉米同属玉米种（Zea mays）,为一年生草本植物,生长势强,具有高分蘖性和分枝性、籽粒蛋白质含量高、对多种真菌类疾病免疫或高抗等优点,是玉米育种可利用的优质基因源。掖515为我国骨干自交系,具有农艺性状优良、配合力高、穗行数多等突出优点,但籽粒品质欠佳,高感青枯病、粗缩病和褐斑病。本工作以玉米骨干自交系掖515和墨西哥类玉米为亲本产生的F₁植株为材料,以掖515为轮回亲本,采用不同自交和回交相组合的方式获得BC₁F₃和BC₂F₂群体（其后代分别为群体Ⅰ、群体Ⅲ）;同时,结合组织培养的方法得到了相应世代的另外2个群体（其后代分别为群体Ⅱ、群体Ⅳ）,即分别取BC₁F₁植株自交或回交的幼胚诱导胚性愈伤组织,后者经过8-9月的继代培养后再生植株（BC₁F₂和BC₂代）,再生植株自交结籽产生BC₁F₃和BC₂F₂代。经过数代自交,这些群体的后代基本达到株系内整齐一致,形态特征及产量类似普通玉米自交系,其中有些自交系（株系）表现出优异的农艺性状。不同株系的形态学和细胞学观测选取4个群体进行形态特征和细胞学观测,每群体随机取样30株系（自交系）。群体内株系间的性状差异明显。一些株系仍具有分蘖性、分枝性、苞叶叶片化、披针形叶片等来自Zea mays ssp.mexicana亲本的性状,其中群体Ⅱ中带有野生亲本性状的株系比率最高,达63.3%;在4个群体中,感染青枯病,粗缩病的株系频率低于10%,表明野生亲本的优异抗性基因可能遗传给后代。每个群体中随机选取5个株系进行染色体核型分析,确定了所有株系体细胞染色体数均为2n=20,未发现染色体数目的变化。C-带带型显示异染色质位于端部或者亚端部,在不同株系间存在着多态性,主要表现为带的有无、大小和染色深浅的变化。不同株系间染色体臂比变化较明显。掖515的核型公式为2n=18m+2sm,6号染色体为亚中部着丝粒染色体（sm）,其余染色体为中部着丝粒染色体（m）;株系Ⅰ-12（群体Ⅰ）的染色体4、7、8、9的臂比明显增大,由m变为sm,核型公式为2n=10m+10sm;株系Ⅱ-96、Ⅲ-77、Ⅳ-18的核型公式为2n=12m+8sm、2n=14m+6sm、2n=10m+10sm。群体Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ分别有26%、38%、32%、34%的染色体臂比与掖515的相比差异显著。以墨西哥玉米基因组DNA为探针对这些株系进行GISH分析,表明在它们的根尖细胞中不存在整条墨西哥玉米的染色体,也不存在整个的染色体臂,只有明显的墨西哥玉米染色体片段存在,且有些株系根尖细胞中没有检测到杂交信号。因此,这些株系的核型变化不是由于整条墨西哥玉米染色体存在造成。GISH分析表明,群体Ⅰ（BC₁F₃后代）平均只有3.3条染色体整合有异源染色体片段;而相对应的通过组织培养产生的群体Ⅱ平均每细胞中有6.5条染色体渐渗有野生亲本的遗传物质;群体Ⅲ、Ⅳ每株系分别有2.5和5.9条染色体携带野生亲本的染色体片段。杂交信号在10条染色体的分布频率是不同的,在5号染色体有较高检测频率（50%以上）,其次是6号染色体。杂交信号点主要分布在染色体端部或亚端部。组织培养促进异源染色质的渐渗在群体Ⅱ、Ⅳ中,带有明显野生亲本性状的株系比率分别为63.3%和36.7%,而对应的群体Ⅰ、Ⅲ分别为40.0%和20.0%。群体Ⅱ、Ⅳ中,染色体臂比与掖515的差异显著者分别为38%和34%,高于对应群体Ⅰ、Ⅲ的26%和32%。不同株系细胞的GISH分析也得出;在群体Ⅱ、Ⅳ中,携带野生亲本染色体片段的染色体数平均是对应群体Ⅰ、Ⅲ的2倍左右。即组织培养过程促进了异源染色质的渐渗。在不同株系中,GISH信号的大小也存在明显的差异。在群体Ⅰ中,中型（M型）信号点最多,有18个,占总信号点的54.5%;大型（L型）信号点有9个,占27.3%;小型（S型）所占比例最少,只有18.2%。在群体Ⅱ中,小、中、大信号点分别为28、22和16个,相应的百分比分别为42.4%,33.4%和24.2%,即小片段渐渗系最多。在群体Ⅲ中,S型信号点最少,仅有9.5%;M型的信号最多,有12个,占57.2%;L型的信号有7个,占33.3%。而在对应群体Ⅳ中,L型的信号最多,占45.5%;M型和S型分别占34.1%,20.5%。即BC₁F₂代经过组织培养过程促进了小片段渐渗系的产生,有效的降低了连缀效应;而BC₂代经过组织培养过程虽提高了异源染色质的渐渗率,但小片段渐渗系增加幅度较低。利用Zea mays ssp.mexicana为种质创造出优异的玉米自交系以骨干自交系掖478、掖502、P138和黄早4为测交种与经过细胞学鉴定的高代渐渗系配制杂交组合。152个杂交组合在济南和潍坊两地分别种植,以掖单12（掖478×掖515）,农大108,郑958为对照,进行农艺性状和产量测试。有54.6%杂交组合的（潍坊）产量高于对照掖单12;有26个（17.1%）的杂交组合产量比对照农大108增产或相当;有15个（9.9%）比郑958增产或相当。其中杂交组合SD00333×黄早4等比农大108和郑958显著增产,表明在渐渗系的产生过程中,来自野生亲本的一些优异（等位）基因得以保留。选取产量高、农艺性状优良的渐渗系为亲本,与优良自交系B-9、昌7-2配制杂交组合,进行产量比较实验。有3个杂交组合的产量显著高于对照登海9号和郑958,显示出有很好的应用前景。Zea mays ssp.mexicana是改良玉米品质的适宜种质对双亲和部分渐渗系进行籽粒蛋白质含量测定,发现渐渗系间蛋白质含量存在较大差异,一些自交系的总蛋白含量显著高于掖515,但低于墨西哥玉米。墨西哥玉米胚乳蛋白含量（22.51%）和籽粒蛋白含量（21.47%）均显著高于掖515的。这表明野生亲本的高蛋白相关基因可能渐渗到入选的自交系中。由于胚乳在整个籽粒中占80%以上,是营养物质储存场所,胚乳的蛋白质品质是决定玉米籽粒品质的重要因子。对墨西哥玉米和掖515的胚乳进行了蛋白质表达图谱分析。在TCA/丙酮方法提取的样品中,墨西哥玉米和掖515中分别检测到253和215个蛋白质点,有58个为差异显著点,其中在墨西哥玉米中表达上调的点有22个（8.7%）,特异表达点为11个（4.35%）。在Tris缓冲液提取的样品中,在墨西哥玉米和掖515中分别检测到255和231个蛋白质点,有49个为差异显著点,其中在墨西哥玉米中表达上调的点有17个（6.67%）,特异表达点为13个（5.10%）。这些结果表明,在玉米的驯化过程中一些影响种子蛋白质含量的基因有可能丢失或表达受抑,因此,通过远缘杂交将这些基因重新导入普通玉米对于丰富玉米育种材料有具有重要意义。该工作不仅探索了从墨西哥玉米向普通玉米转移有用基因的途径和方法,获得了一批优异育种材料,确定了墨西哥玉米在玉米育种中的价值,而且从群体和个体相结合的角度检测了不同群体中墨西哥玉米遗传物质在渐渗系中的频率和渐渗片段的大小,为高效获得玉米渐渗系提供了重要资料,肯定了组织培养能有效促进渐渗系产生。并通过双向凝胶电泳分析,揭示了墨西哥玉米是改良玉米籽粒品质的重要种质。该工作创造出的渐渗系也为来自墨西哥玉米的优异基因鉴定及分子标记定位奠定了良好的基础。

全文目录

中文摘要  6-10
Abstract  10-17
第一章前言  17-38
  1.1 玉米的起源与进化  17-20
  1.2 玉米和类玉米的形态特征差异及遗传基础  20-23
  1.3 玉米的遗传多样性  23-25
  1.4 玉米育种的历史和现状  25-27
  1.5 Zea mays ssp.mexicana在玉米种质创新中的价值  27-30
    1.5.1 利用野生近缘种创造新种质方法和现状  27-28
    1.5.2 墨西哥玉米(Zea mays ssp.mexicana)的利用研究  28-30
  1.6 外源遗传物质的鉴定方法及在玉米远缘杂种后代中的应用  30-35
  1.7 玉米种子蛋白研究的现状  35-36
  1.8 本工作的目的及意义  36-38
第二章材料和方法  38-52
  2.1 实验材料  38
  2.2 双亲间遗传多样性分子检测  38-40
    2.2.1 双亲叶片DNA的提取  38-39
    2.2.2 SSR引物序列  39
    2.2.3 SSR反应体系和反应条件  39
    2.2.4 PCR反应产物的电泳分析  39-40
    2.2.5 双亲多态性检测  40
  2.3 杂种及其后代的产生  40-41
  2.4 胚性愈伤组织诱导、继代和植株再生  41
  2.5 杂种后代的田间种植和观察统计  41
  2.6 渐渗系配合力测定  41-42
  2.7 杂种的细胞学研究  42-44
    2.7.1 根尖染色体数目、核型  42-44
  2.8 GISH及18S、5.8S和26S rDNA的FISH分析  44-47
    2.8.1 染色体制备  44
    2.8.2 FISH探针序列的制备  44-45
    2.8.3 探针的标记、检测及封阻DNA的处理  45
    2.8.4 杂交  45-47
  2.9 种子蛋白质分析  47-52
    2.9.1 蛋白质含量分析  47
    2.9.2 胚乳氨基酸含量测定  47-48
    2.9.3 胚乳蛋白的双向凝胶电泳  48-52
      2.9.3.1 样品的制备  48-49
      2.9.3.2 蛋白定量  49
      2.9.3.3 双向电泳  49-52
第三章结果与分析  52-88
  3.1 玉米与墨西哥玉米的遗传距离  52-53
  3.2 远缘杂种及其后代的表型  53-58
    3.2.1 掖515与墨西哥玉米杂种的产生  53-54
    3.2.2 杂种F_1表型  54
    3.2.3 F_2代、BC_1代植株的表型  54-57
    3.2.4 F_2、BC_1植株后代的表型  57-58
  3.3 渐渗群体的构建和农艺性状分析  58-62
    3.3.1 群体的构建  58-60
    3.3.2 不同群体农艺性状比较  60-62
  3.4 不同群体根尖细胞染色体分析  62-67
  3.5 不同群体细胞的GISH及ISH分析  67-73
    3.5.1 标记探针的点印迹检测  67
    3.5.2 18S-5.8S-26S rDNA的FISH分析  67-68
    3.5.3 不同群体中外源渐渗片段的分布  68-69
    3.5.4 杂交信号在不同染色体上的分布和频率  69-71
    3.5.5 杂交信号分布在染色体上的位置和大小  71-73
  3.6 优良育种材料的选育  73-78
    3.6.1 优良渐渗系的主要农艺性状  73-74
    3.6.2 自交系的GISH鉴定  74
    3.6.3 自交系配合力测定试验  74-77
    3.6.4 优良杂交组合的产量比较试验  77-78
  3.7 籽粒蛋白质分析  78-88
    3.7.1 胚乳氨基酸含量分析  78-81
    3.7.2 蛋白质含量分析  81
    3.7.3 胚乳蛋白双向凝胶电泳分析  81-88
第四部分讨论  88-99
  4.1 野生种质资源利用价值及策略  88-90
  4.2 提高渐渗杂交效率的措施  90-92
  4.3 墨西哥玉米和掖515杂交后代的核型分析  92-94
  4.4 玉米与墨西哥玉米杂交后代的利用价值  94-96
  4.5 利用玉米野生资源拓宽玉米种质资源的适宜技术路线和方法  96-97
  4.6 本工作的创新点和不足之处  97-99
参考文献  99-113
附录鉴定双亲遗传距离时所用的SSR标记  113-114
致谢  114-115
攻读博士学位期间完成的学术论文目录  115

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