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杨柳田头菇生活史及分类地位研究

作　者: 周会明
导　师: 魏云林；赵永昌
学　校: 昆明理工大学
专　业: 微生物学
关键词: 杨柳田头菇生活史生长速度种间杂交分子系统学
分类号: S646
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

本文从交配型、交配型因子与菌丝生长速度关系、种间杂交以及分子系统学出发,对杨柳田头菇(Agrocybe salicacola)的生活史及分类地位进行了深入的研究。以菌株YAASM0711的子实体为材料,稀释分离法获得224个单孢菌株,其中单核菌株210个,交配试验及单孢出菇证明其性遗传模式为四极异宗结合,4种交配型的比例为A1B1:A1B2:A2B1:A2B2为47：59：53：51。结果表明,杨柳田头菇四种交配型的数量、比例与单孢萌发速度、生长速度相关,其中生长速度较慢的菌株基本上属于一种交配型,只有少数生长慢的菌株属于另外两种交配型。值得注意的是,尽管快(Fast)-慢(Slow)配对的双核体与快(Fast)-快(Fast)配对的双核体在YPD平板上生长速度无明显差别,但在聚丙烯栽培袋上F-S双核体的生长速度明显快于F-F双核体,说明交配因子A和B与生长速度基因可能相连锁,且存在着重组现象,F-S交配的双核体在生长上有优势。为进一步验证杨柳田头菇的性遗传模式,并探索田头菇属不同分离菌株的关系,以菌株YAASM0711交配型为基础,研究了同种的YAASM0962、YAASM0969菌株以及茶树菇(A. aegerita)人工栽培菌株CS45的交配型分布情况。结果发现,三个菌株的性遗传模式均为四极异宗结合,其中YAASM0962 4种交配型A3B3、A3B4、A4B3、A4B4的比例为为6：10：14：7；菌株YAASM0969只有两种交配型,为偏分离,2种交配型A5B5、A6B6的比例为38：35；茶树菇同样出现偏分离,即也只有两种极性,2种交配型A7B7、A8B8的比例为51：55。杂交试验证明,YAASM0711与YAASM0962、YAASM0969、YAASM0967、CS45的单孢菌株之间杂交能形成三生菌丝,且除茶树菇外均能产生子实体,杨柳田头菇A. salicacola不仅是独立的形态学种而且是独立的生物学种。由于地理环境的差异导致它们的交配因子存在着多个复等位基因,导致YAASM0711的任何一个单孢菌株与YAASM0962、YAASM0969、YAASM0967的任何交配型菌株都能交配结实,在自然交配和人工栽培选育过程中,其交配因子基因之间不断的重组、插入或删除引发偏分离现象,人工选择加速这种现象的发生,交配因子亚基减少导致偏分离发生,极性菌株比例失调(如菌株YAASM0962),甚至使一些极性丢失(如菌株YAASM0969与CS45)。本文还利用SPSS统计软件对杨柳田头菇菌株单孢生长速度与交配型之间的相关性做出分析,结果证明该菌的单孢生长速度与极性、交配因子存在较高的相关性,尤其是极性,存在一个单孢生长极慢的极性。对于交配因子,单孢生长速度与交配因子A1最相关,其次为B1、B2、A2,而且可以说明交配因子的亚基1比2更与单孢生长速度相关,它在一定的程度上起关键作用。田头菇属作为我国一类广泛种植的美味食用菌,其多个名称以及可能为一混合种群的复杂性,包括了茶树菇(A. aegerita)、柱状田头菇(A. cylindraceae)、茶薪菇(A. chaxingu)和杨柳田头菇(A. salicacola),这给研究者带来很多不便。本研究在广泛收集供试菌株的基础上,通过测定ITS及18SrDNA序列,结合GenBank已有序列,较为完整的分析了供试菌株的分类地位。结果显示,与Agrocybe属内的其它物种相比较,供试菌株更好地被聚在一起,且供试菌株可以明显分为两大类,从分子水平也证明杨柳田头菇A. salicacola是独立的种。同时,在A. aegerita种群内,其多样性较高,可能还存在不同的种。因此,核糖体RNA序列特征及杂交分析能够很好的解决A. aegerita种类混淆的问题,为资源收集及育种提供一种便利、准确的方法。总之,杨柳田头菇与茶树菇属于田头菇属内不同种,其交配型均为四极异宗结合。在该属内也许还存在着一些变种和亚种,有待进一步更加深入的研究。

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摘要 4-6ABSTRACT 6-12插图和附表清单 12-14第一章文献综述 14-28 1.1 田头菇属真菌研究状况 14-22 1.1.1 田头菇属真菌简介 14 1.1.2 田头菇属真菌生物学特征 14-16 1.1.3 田头菇属真菌遗传 16-18 1.1.4 田头菇属真菌抗重金属胁 18-19 1.1.5 田头菇属真菌栽培和菌丝体发酵 19-20 1.1.6 田头菇属真菌药理作用 20-21 1.1.7 展望 21-22 1.2 蕈菌交配型的研究状况 22-24 1.2.1 担子菌生活史简介 22-23 1.2.2 交配系统研究状况 23-24 1.2.3 四极性蕈菌交配型常规测定 24 1.3 分子生物学标记在蕈菌研究状况 24-27 1.3.1 常用分子标记类型简介 24-25 1.3.2 菌株间的遗传差异鉴定 25 1.3.3 遗传多样性以及亲缘关系 25-26 1.3.4 亲本选择和杂交子鉴定 26 1.3.5 基因定位以及克隆技术 26-27 1.4 立题依据 27-28第二章杨柳田头菇生活史研究 28-37 2.1 材料 28 2.1.1 供试菌株 28 2.1.2 培养基 28 2.2 实验方法 28-31 2.2.1 菌种分离 28 2.2.2 人工栽培 28-29 2.2.3 人工栽培子实体采集 29 2.2.4 人工栽培子实体形态 29 2.2.5 收集担孢子 29-30 2.2.6 制备担孢子菌丝 30 2.2.7 初步获取单孢菌株 30-31 2.2.8 出菇实验验证、确定单孢菌株比例 31 2.2.9 交配试验 31 2.3 结果 31-36 2.3.1 子实体形态 31-32 2.3.2 担孢子形态及孢子的萌发速度 32-33 2.3.3 获取单孢菌株并确定其比例 33-34 2.3.4 单孢交配实验 34-35 2.3.5 生活史 35-36 2.4 讨论 36-37第三章杨柳田头菇交配型因子与菌丝生长速度关系研究 37-45 3.1 材料 37 3.1.1 供试菌株 37 3.1.2 培养基 37 3.1.3 分析软件 37 3.2 方法 37-39 3.2.1 菌株的培养 37 3.2.2 统计分析 37-38 3.2.3 测定单孢生长速度 38 3.2.4 四种极性生长速度测定及分析 38 3.2.5 杂合子平板与栽培袋生长速度测定 38-39 3.3 结果 39-44 3.3.1 单孢生长速度 39-40 3.3.2 四种极性生长速度 40-41 3.3.3 四种交配因子生长速度 41-42 3.3.4 杂合子平板与栽培袋生长速度 42-44 3.4 讨论 44-45 3.4.1 杨柳田头菇两交配因子可能都与生长速度因子相连锁 44 3.4.2 与交配因子相连锁的生长速度基因应为调控元件 44-45第四章田头菇属不同分离菌株杂交及杂合子出菇鉴定 45-56 4.1 材料 45-46 4.1.1 供试菌株 45 4.1.2 培养基 45-46 4.2 方法 46-47 4.2.1 菌株YAASMO(962、969、967)与茶树菇担孢子收集、单孢菌丝获得及极性确定 46 4.2.2 菌株YAASMO(711、962、969、967)及茶树菇杂交 46 4.2.3 杂合子出菇 46-47 4.3 结果 47-54 4.3.1 菌株YAASMO(962、969)及茶树菇单孢及极性确定 47-48 4.3.2 菌株YAASMO(711、962、969、967)及茶树菇之间杂交 48-50 4.3.4 杂合子出菇鉴定结果分析 50-54 4.4 讨论 54-56 4.4.1 野生杨柳田头菇与茶树菇交配型应为四极异宗结合且为是不同种 54-55 4.4.2 覆土栽培杨柳田头菇优于袋栽法 55 4.4.3 不同地域杨柳田头菇菌株其交配因子基因有多个复等位基因 55-56第五章杨柳田头菇的分子标记(SSU rDNA、ITS) 56-67 5.1 材料 56-59 5.1.1 供试菌株 56-58 5.1.2 培养基 58 5.1.3 扩增反应的引物 58-59 5.2 方法 59-61 5.2.1 母种菌丝的活化 59 5.2.2 液体菌丝的培养 59 5.2.3 菌丝体DNA的提取 59-60 5.2.4 PCR扩增及序列测定 60 5.2.5 序列比对及系统树构建 60-61 5.3 结果 61-66 5.3.1 DNA提取电泳图 61 5.3.2 ITS序列及系统分析 61-64 5.3.3 18S rDNA序列及系统分析 64-66 5.4 讨论 66-67第六章总结 67-69致谢 69-70参考文献 70-81附录A 攻读硕士期间发表论文目录 81-82附录B 攻读硕士期间获奖情况 82-83附录C 实验药品与设备 83-84

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