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小百部的抗肿瘤活性成分及其体内外分析

作　者: 周丽波
导　师: 陈道峰
学　校: 复旦大学
专　业: 生药学
关键词: 小百部抗肿瘤甾体皂苷蜕皮甾酮含量测定质量评价药代动力学代谢 HPLC-ELSD
分类号: R285
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

小百部为百合科（Liliaceae）天门冬属（Asparagus）植物羊齿天门冬（Asparagus filicinus Buch.-Ham）的根,用于治疗气管炎、肺炎和咳嗽。据文献报道,小百部具有较强的抗肿瘤活性,我们的前期研究结果表明其总皂苷部位对多种肿瘤细胞株均有明显的生长抑制作用。本课题以药理活性为依据,研究目的是探讨小百部抗肿瘤药效物质基础并为小百部总皂苷（AAPS）的研究与开发提供科学依据。为此首先对AAPS进行化学成分研究,阐明主要药效物质基础,在此基础上建立AAPS及小百部药材的定量分析方法,并对AAPS的药代动力学做了初步考察。我们首先对AAPS的化学成分进行研究,采用大孔吸附树脂、正反相硅胶柱色谱、凝胶色谱以及红外、质谱、核磁共振（氢谱、碳谱、HSQC、HMBC和TOCSY等）波谱技术和化学方法从中分离鉴定了16个化合物,其中12个为甾体皂苷,另外4个为蜕皮甾酮类化合物。其中7个甾体皂苷为新化合物,分别命名为小百部皂苷甲（ZS-1）、乙（ZS-2）、丙（ZS-3）、丁（ZS-4）、小百部苷E（ZS-5）、F（ZS-6）和小百部苷G（ZS-7）。另外5个已知甾体皂苷为小百部甙A（ZS-8）、小百部甙B（ZS-9）、天冬甙B（ZS-10）、小百部甙C（ZS-11）和天冬甙A（ZS-12）;4个蜕皮甾酮为:蜕皮甾酮（ZY-1）、20-羟基蜕皮甾酮（ZY-2）、turkesterone（ZY-3）和20,22-异丙亚二氧基蜕皮甾酮（ZY-4）。对其中的11个化合物进行体外抗肿瘤活性评价显示,蜕皮甾酮类化合物均无细胞毒活性,甾体皂苷ZS-1、ZS-2、ZS-3、ZS-4、ZS-5和ZS-9对人肺腺癌A-549和乳腺癌MCF-7肿瘤细胞株均有不同程度的生长抑制活性,ZS-8对A-549肿瘤细胞株显示较弱的活性(EC₅₀值为9.37μg/ml),但对MCF-7肿瘤细胞株无生长抑制作用。其中ZS-3活性最强,EC₅₀值分别为2.28和3.04μg/ml,ZS-4对A-549显示较强的生长抑制活性(EC₅₀值为2.38μg/ml),但对乳腺癌MCF-7肿瘤细胞株作用较弱(EC₅₀值为10.29μμg/ml)。由此可以明确,甾体皂苷类化合物是AAPS抗肿瘤作用的主要活性成分。在分离得到化学对照品的基础上,建立了AAPS中主要成分（ZS-11、ZS-7、ZY-2）及活性成分（ZS-1、ZS-5、ZS-8、ZS-9）的含量测定方法。利用此方法对AAPS的不同制备工艺进行验证发现,本实验室先前制定的大孔树脂纯化工艺制得的AAPS纯度最高,确认为最佳工艺。此外,还利用HPLC-ELSD方法对购自不同地区的13批小百部药材进行了定量分析,结果发现,小百部药材中7个指标成分的含量相差很大。整体动物实验发现,荷瘤小鼠口服给予AAPS后无抗肿瘤作用。为了明确其口服体内无效的原因,我们对AAPS的水溶性、胃肠道环境下的稳定性、小肠的吸收情况、静脉注射给药后的药动学以及其在口服给药后的代谢情况作了初步考察。在改善AAPS水溶性的研究中,筛选出一种增溶剂Solutol HS-15可显著提高AAPS在水中的溶解度,其中的活性成分含量可达到体内研究的要求。通过考察AAPS在人工胃液及人工肠液中的稳定性发现,AAPS中的大部分成分胃肠道环境下稳定,只有ZS-7在人工胃液孵育3h后中含量升高近50%,表明AAPS中有其他化学成分在酸性条件下降解转化成ZS-7,致使其含量升高。以外翻小肠囊为模型考察了AAPS的吸收情况,结果发现,相比于蜕皮甾酮,甾体皂苷的小肠透过率很低。在AAPS 100mg/ml浓度下,待测甾体皂苷的吸收量低于分析方法的检测限而不能检出。由此不难看出,活性成分在小肠内吸收差,生物利用度低是AAPS口服给药无抗肿瘤作用的主要原因。通过静脉给药方式对AAPS的药动学进行了初步考察。结果发现,AAPS中ZS-11的含量大于ZS-7,而在尾静脉给予大鼠200mg/kg剂量的AAPS后,血浆中ZS-11的含量明显低于ZS-7,且ZS-7的消除半衰期(T_1/2β=9.86h)明显长于ZS-11(T_1/2β=1.51h),提示给药后ZS-11很快代谢转化成ZS-7,致使ZS-7含量升高的同时也使后者的体内消除过程延长。静脉给药在100、200mg/kg两个剂量下溶血现象严重,说明AAPS不能用于静脉给药。此外,通过对大鼠口服给予AAPS（2g/kg）后对粪便样品进行定量分析发现,四个活性成分（ZS-1、ZS-5、ZS-8、ZS-9）中的ZS-8、ZS-9的累计排泄量分别是给药量的2倍和近4倍,ZS-1和ZS-5的累计排泄量分别是给药量的72%和44%,提示AAPS中含量高的皂苷类化学成分（如ZS-11等）可能经过体内代谢过程转化成了活性成分（ZS-8和ZS-9）,同时活性成分主要随粪便排泄。本文明确了AAPS主要药效物质基础和指标性成分,建立了AAPS及小百部药材中活性成分和主要成分的定量分析方法;同时对AAPS的药代动力学进行了初步考察,明确了活性成分吸收差,生物利用率低是导致口服给药无抗肿瘤作用的主要原因。

全文目录

中文摘要  5-7
英文摘要  7-10
前言  10-12
第一章小百部的抗肿瘤活性成分  12-38
  第一节结果与讨论  12-28
    一、新化合物结构解析  14-24
    二、己知化合物结构解析  24-26
    三、抗肿瘤活性筛选结果  26-27
    四、小结与讨论  27-28
  第二节实验部分  28-36
    一、仪器、材料与试剂  28
    二、提取分离  28-30
    三、化合物的水解与单糖鉴定  30-32
    四、各化合物主要理化数据  32-36
  参考文献  36-38
第二章小百部总皂苷及药材的含量测定  38-55
  第一节 AAPS的含量测定及制备工艺验证  38-48
    一、AAPS的含量测定  38-44
    二、AAPS制备工艺验证  44-47
    三、小结与讨论  47-48
  第二节小百部药材的含量测定  48-54
    一、仪器、材料与试剂  48
    二、色谱行为  48
    三、样品溶液制备方法考察  48-50
    四、方法学考察  50-53
    五、样品测定  53-54
  参考文献  54-55
第三章小百部总皂苷的药动学考察  55-76
  第一节改善AAPS溶解性的研究  55-61
    一、HPLC-ELSD分析方法的建立  55-59
    二、增溶剂的筛选  59-60
    三、小结与讨论  60-61
  第二节 AAPS体内稳定性考察  61-63
    一、仪器、药品与试剂  61
    二、AAPS在人工胃液中的稳定性  61-62
    三、AAPS在人工肠液中的稳定性  62
    四、小结与讨论  62-63
  第三节 AAPS离体外翻小肠吸收考察  63-65
    一、仪器、药品与材料  63
    二、实验方法  63-64
    三、实验结果  64
    四、小结与讨论  64-65
  第四节 AAPS体内药动学考察  65-71
    一、分析方法的建立  65-68
    二、大鼠静脉给药的药动学考察  68-69
    三、大鼠口服给药的药动学考察  69-70
    四、小结与讨论  70-71
  第五节 AAPS口服给药的代谢物分析  71-76
    一、分析方法的建立  71-74
    二、大鼠口服给药的代谢物分析  74
    三、小结与讨论  74-76
结语  76-77
综述天门冬属植物化学成分及药理作用研究进展(2000-2006)  77-96
  参考文献  90-96
致谢  96-97
附图目录  97-99
附图  99-133

小百部的抗肿瘤活性成分及其体内外分析

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