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质膜型Ca～（2+）-ATPase基因的分离与表达研究

作　者: 李大志
导　师: 邓子牛；谢丙炎
学　校: 湖南农业大学
专　业: 果树学
关键词: β-氨基丁酸 cDNA-AFLP 质膜型钙调转运蛋白酶 克隆 表达分析
分类号: S432.23
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要


在农业生产中，植物病害的为害造成了巨大的损失，而生产上采用的高毒、高残留农药对产品和环境均造成严重的污染，已成为制约我国无公害农产品生产可持续发展的突出问题。研究开发可持续、环保型控制技术是解决这一问题的关键。β-氨基丁酸（BABA）是从经暴晒的番茄根系中分离得到的一种次生代谢非蛋白氨基酸，具有高效、广谱的诱抗活性，可诱导多种作物抵抗由卵菌、真菌、细菌、病毒和线虫引起的病害，保护植物免受病害为害。要开发利用BABA诱导植物抗病潜能，创新有害生物综合治理途径与技术，必须进一步认识BABA的诱导抗病机理。从功能基因组学角度分析BABA诱导植物防御反应过程中信号互作功能基因群的表达特征，是揭示寄主—病原物互作的分子机制的新思路。过去，基于技术局限，关于植物诱导抗病的基因转录调控分析大多集中在若干已知PR蛋白和个别SA信号传导路径中的几个基因上。现在，利用功能基因组学的多项技术，可以明确更多应答诱抗时植物体内转录发生改变的基因，从而更准确、全面地认知植物诱导抗病行为机制。本研究以番茄为材料，利用cDNA-AFLP基因转录谱分析技术研究番茄根部组织应答BABA诱导后基因转录谱，取得的结果如下：1．由于植物总RNA提取的质量具有很强的组织特异性，对试验中常用的TRIzol Reagent、RNAplant、TRIpure Reagent等三种RNA提取试剂盒进行了番茄成熟老化组织RNA提取效果的研究，发现RNAplant能有效从多种成熟组织中提取纯度高、完整性好的RNA，符合需要总RNA质量较高的分子试验要求。2．采用25mmol／L BABA溶液处理番茄六叶期幼苗，蒸馏水处理作为对照，运用cDNA-AFLP差别显示技术对基因转录谱进行分析。从显示出的约5000个转录基因片段（Transcript-derived fragments，TDFs）中发现了23个受BABA诱导上调基因片段（BABA Induced Fragment，BIF），6个诱导下调片段。通过克隆测序最终得到12个转录上调基因序列。用生物信息学方法分析这12个cDNA片段的功能，可将其分为5种类型：①防卫反应基因：BIF13，BIF14为病程相关蛋白基因P69家族成员，它们具有蛋白水解酶功能；②转运蛋白基因：BIF2，BIF3、BIF6、BIF17，BIF4，负责细胞内外离子、水和小分子物质的跨膜运输；③信号传导蛋白：BIF5为Ca2+绑定蛋白，结合游离Ca2+，参与Ca2+信号传导；④大分子蛋白相关基因：BIF 1为协助蛋白复性的分子伴侣蛋白编码基因；⑤功能未知基因：BIF10、BIF11、BIF12。3．对上述基因片段进行序列分析，发现BIF3、6、17三个基因片段序列长度一致，同源性高达99％，为编码细胞逆境信号通路中的钙调转运蛋白酶(Calcium transporting-ATPase，Ca2+-ATPase)基因片段。利用分子系统发育分析对Ca2+-ATPase基因家族进行了细分；在此基础上，依据同源克隆的原理，结合步进PCR和RACE方法获得这个质膜型（Plasma membrane-type，PM-type）Ca2+-ATPase全长cDNA序列，基因全长3389bp，开放阅读框为3090bp，编码1029个氨基酸的蛋白质。这是首次在茄科类植物中克隆到PM型Ca2+-ATPase。4．利用Northern Blotting分子杂交对靶标Ca2+-ATPase基因受BABA诱导的时空规律进行了研究，结果显示，Ca2+-ATPase基因在根中表达量最高，叶其次，茎中最弱；基因的转录水平在6—12h达到最高，持续到72h仍有微量表达。5．利用生物信息学手段对靶标基因编码蛋白的理化性质和二、三级结构、代谢途径进行分析，并构建了该蛋白的理论三维模型，发现该基因编码的多肽链有7个基序（motif），4个保守功能结构域（domain），8个跨膜螺旋，都与蛋白的活性有关，该基因参与Ca2+信号代谢途径。对靶标基因进行了分子系统发育分析，找到了该基因在生物界进化的地位。6．利用SMART和Primer Extension技术相结合，构建了一个富集BABA诱导抗性相关基因的cDNA全长文库，原始文库的滴度达到为4.4×106，重组率为96％，插入片段大小分布在400—1800bp，平均大小为700—1000bp；为克隆响应BABA诱导的其他重要抗性基因全长cDNA奠定了基础。7．利用了Ca2+-ATPase的保守区段设计基因特异引物（Gene Specific Primer，GSP），在两个经受低温锻炼的柑橘品种中进行半定量RT-PCR，试验结果表明此基因广泛存在于植物组织内部，属诱导表达型基因，积极参与了植物逆境信号转导过程。

全文目录


摘要  4-6
Abstract  6-16
第一章 文献综述及前言  16-40
  1 β-氨基丁酸诱导植物抗病作用的研究进展  16-23
    1.1 BABA诱导植物的抗病作用  16-18
      1.1.1 BABA的广谱诱抗活性  16-17
      1.1.2 BABA对植物线虫的诱抗活性  17-18
      1.1.3 BABA与其他化合物的互作增效作用  18
    1.2 BABA的使用方法及在植株体内的吸收、运转和代谢  18-20
      1.2.1 BABA处理时间、方式及有效使用浓度  18-19
      1.2.2 植物组织对BABA的吸收  19
      1.2.3 BABA的运转  19-20
      1.2.4 BABA的新陈代谢  20
    1.3 BABA诱导植物抗病的生理、生化作用机制  20-22
      1.3.1 生理屏障的产生  20
      1.3.2 过敏反应和活性氧物质的生成  20-21
      1.3.3 病程相关蛋白的积累  21
      1.3.4 植物保卫素的产生  21-22
      1.3.5 抗病信号传导途径  22
    1.4 BABA结构与功能的关系  22-23
  2 未知基因的鉴定方法  23-32
    2.1 mRNA差异显示技术  23-24
    2.2 代表性序列差异分析  24-25
    2.3 抑制性差减杂交  25-26
    2.4 基因表达系列分析  26-27
    2.5 基因鉴定集成法  27-28
    2.6 cDNA微阵列和基因芯片  28
    2.7 cDNA-AFLP技术及其研究进展  28-32
      2.7.1 cDNA-AFLP技术的基本原理  29
      2.7.2 cDNA-AFLP的主要过程  29-31
      2.7.3 cDNA-AFLP技术的特点评价  31-32
      2.7.4 cDNA-AFLP技术的应用现状  32
  3 植物细胞Ca~(2+)-ATPase及其在逆境信号转导中的作用  32-38
    3.1 Ca~(2+)-ATPase在Ca~(2+)信号转导中的作用  32-33
      3.1.1 Ca~(2+)信号转导的分子途径  32-33
      3.1.2 Ca~(2+)-ATPase在Ca~(2+)信号转导中的作用  33
    3.2 Ca~(2+)-ATPase的理化特性  33-35
      3.2.1 Ca~(2+)-ATPase的类型  33
      3.2.2 Ca~(2+)-ATPase的亚细胞定位  33-34
      3.2.3 Ca~(2+)-ATPase的结构  34
      3.2.4 Ca~(2+)-ATPase的分子量  34
      3.2.5 Ca~(2+)-ATPase的生化特性  34-35
    3.3 Ca~(2+)-ATPase的激活与抑制  35
    3.4 Ca~(2+)-ATPase的逆境应答  35-36
    3.5 Ca~(2+)-ATPase基因的克隆  36-37
    3.6 存在问题与展望  37-38
  4 本研究的目的意义与技术路线  38-40
    4.1 目的意义  38-39
    4.2 技术路线  39-40
第二章 应用cDNA—AFLP技术分离番茄应答BABA诱导的植物抗病相关基因  40-60
  1 试验材料  40-41
    1.1 植物材料  40
    1.2 主要生化试剂  40-41
  2 方法  41-47
    2.1 β-氨基丁酸诱导处理  41
      2.1.1 育苗  41
      2.1.2 BABA使用浓度的确定  41
      2.1.3 取样  41
    2.2 RNA提取  41-42
    2.3 cDNA的合成  42-43
      2.3.1 无RNase的DNase处理  42
      2.3.2 cDNA的合成  42-43
    2.4 cDNA-AFLP  43-46
      2.4.1 模板制备  44
      2.4.2 扩增反应  44-46
    2.5 差异表达片段回收、克隆与测序  46-47
      2.5.1 差异表达片段的回收  46
      2.5.2 回收片段的连接转化  46-47
      2.5.3 阳性(白斑)菌落PCR扩增鉴定与摇菌培养  47
      2.5.4 阳性克隆的序列测定  47
    2.6 生物信息学分析  47
  3 结果与分析  47-55
    3.1 植物的培育  47-48
    3.2 BABA使用浓度的确定  48
    3.3 RNA的提取  48
    3.4 双链cDNA的合成、酶切连接和预扩增结果  48-49
    3.5 cDNA-AFLP转录图谱  49-51
    3.6 受BABA诱导转录上调基因片段BIF的分析  51-54
      3.6.1 BIF的序列测定  51-52
      3.6.2 BIF序列同源性分析  52-53
      3.6.3 BIF序列的表达模式  53-54
    3.7 受BABA诱导转录下调基因片段的分析  54-55
  4 讨论  55-59
    4.1 cDNA-AFLP技术的利用  55
    4.2 序列BIF17与BABA诱导抗病性  55-56
    4.3 对BABA诱导植物根部抗病分子机理的探讨  56-59
  5 小结  59
  6 图版  59-60
第三章 步进PCR结合RACE方法克隆PM型Ca~(2+)—ATPase基因全长cDNA  60-83
  1 试验材料  61
    1.1 植物材料  61
    1.2 主要生化试剂  61
  2 方法  61-66
    2.1 靶标基因片段BIF17的序列分析  61
    2.2 RNA提取  61
    2.3 步进PCR同源克隆Ca~(2+)-ATPase基因  61-63
      2.3.1 第一链cDNA的合成  61-62
      2.3.2 PCR扩增  62-63
    2.4 RACE获得全长cDNA  63-66
      2.4.1 引物设计:  63
      2.4.2 3′-RACE  63-64
      2.4.3 5′-RACE  64-66
      2.4.4 目的片段回收、克隆与测序  66
  3 结果与分析  66-80
    3.1 靶标基因片段BIF17的序列分析  66-69
      3.1.1 序列组成  66
      3.1.2 序列分析  66-68
      3.1.3 Ca~(2+)-ATPase基因分子系统发育分析  68
      3.1.4 靶标基因BIF17同源基因亚族序列分析  68-69
    3.2 步进PCR克隆Ca~(2+)-ATPase基因  69-73
      3.2.1 第一步同源克隆  69-71
      3.2.2 第二步同源克隆  71-73
    3.3 RACE法获得cDNA全长序列3’、5’末端  73-76
      3.3.1 3’RACE  73-74
      3.3.2 5’RACE  74-76
    3.4 序列拼接  76-78
    3.5 全长序列的验证  78-80
      3.5.1 同源基因的搜索比对  78-79
      3.5.2 全长序列开放式阅读框(ORF)分析  79
      3.5.3 试验验证  79-80
  4 讨论  80-82
    4.1 Ca~(2+)-ATPase在植物逆境信号转导中的重要作用  80-81
    4.2 对新基因克隆策略的思考  81-82
    4.3 Ca~(2+)-ATPase的保守性  82
  5 小结  82-83
第四章 Ca~(2+)-ATPase基因表达研究及功能预测  83-103
  第一节 Ca~(2+)-ATPase基因受BABA诱导表达的时空规律  83-90
    1 试验材料  83
      1.1 植物材料  83
      1.2 主要生化试剂  83
    2 方法  83-85
      2.1 不同RNA提取试剂对番茄成熟组织提取效果研究  83-84
        2.1.1 RNA提取方法  83
        2.1.2 RNA质量检测  83-84
        2.1.3 反转录成cDNA  84
        2.1.4 PCR进行半定量内参检测  84
      2.2 Northern blotting  84-85
        2.2.1 育苗以及取样  84
        2.2.2 RNA提取  84
        2.2.3 甲醛凝胶电泳  84
        2.2.4 转膜  84
        2.2.5 分子杂交  84-85
        2.2.6 洗膜  85
        2.2.7 分子成像  85
    3 结果与分析  85-89
      3.1 RNA提取方法研究  85-88
        3.1.1 RNA样品的凝胶电泳分析  86
        3.1.2 RNA样品的紫外扫描分析  86-87
        3.1.3 RNA样品的产量比较  87
        3.1.4 RT-PCR半定量内参检测  87-88
      3.2 Northern blotting  88-89
    4 讨论  89-90
      4.1 RNA提取  89
      4.2 Northern杂交  89-90
  第二节 Ca~(2+)-ATPase基因的功能预测  90-102
    1 方法  90
    2 结果与分析  90-102
      2.1 蛋白的理化性质分析  90-92
        2.1.1 ProtParam  90-92
        2.1.2 ProtScale  92
      2.2 Interpro搜索对序列进行整体评价  92-93
      2.3 Ca~(2+)-ATPase蛋白二、三级结构预测  93-98
        2.3.1 Motif预测  93-94
        2.3.2 结构域分析  94-97
        2.3.3 Ca~(2+)-ATPase蛋白跨膜结构预测  97-98
      2.4 Ca~(2+)-ATPase蛋白三维模型预测  98-99
      2.5 基因代谢途径分析  99-100
      2.6 分子系统发育分析  100-102
    3 讨论  102
  本章小结  102-103
第五章 番茄应答BABA诱导全长cDNA文库的构建  103-113
  1 试验材料  104
    1.1 植物材料  104
    1.2 主要生化试剂  104
  2 方法  104-109
    2.1 育苗以及取样方法  104
    2.2 RNA的大量提取法  104
    2.3 mRNA分离与提纯  104-105
    2.4 cDNA文库构建  105-109
      2.4.1 cDNA第一链合成  105
      2.4.2 引物延伸法合成cDNA第二链  105-106
      2.4.3 蛋白酶消化  106
      2.4.4 SfI酶切  106
      2.4.5 用CHROMA SPINTM-400进行cDNA大小片段分级  106-107
      2.4.6 ds cDNA与pDNR-LIB载体的连接  107-108
      2.4.7 重组质粒转化进E.coli  108
      2.4.8 测定质粒文库的滴度  108
      2.4.9 文库的扩增  108-109
  3 结果与分析  109-110
    3.1 总RNA提取与mRNA纯化  109
    3.2 单链和双链cDNA的合成  109-110
    3.3 双链cDNA的分级  110
    3.4 cDNA与载体的连接转化  110
    3.5 cDNA文库滴度测定与文库扩增  110
  4 讨论  110-111
    4.1 cDNA文库的质量及其可能影响因素  110-111
  5 小结  111-112
  6 图版  112-113
第六章 Ca~(2+)-ATPase基因在低温锻炼柑橘中的表达分析  113-117
  1 试验材料  113
    1.1 植物材料  113
    1.2 主要生化试剂  113
  2 方法  113-115
    2.1 材料处理  113
    2.2 采样  113
    2.3 总RNA提取  113-114
    2.4 单链cDNA的合成  114
    2.5 半定量内参引物扩增  114
    2.6 PCR扩增  114-115
  3 结果与分析  115
  4 讨论  115-116
  5 小结  116-117
结论  117-118
论文创新点  118-119
下一步工作设想  119-120
参考文献  120-128
附录  128-139
致谢  139-140

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中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 病虫害及其防治 > 植物病害及其防治 > 植物免疫学 > 抗病机理
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