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热休克蛋白70在紫外线致DNA损伤与修复中的作用

作　者: 牛丕业
导　师: 邬堂春
学　校: 华中科技大学
专　业: 劳动卫生与环境卫生学
关键词: 热休克蛋白70 DNA损伤 DNA修复紫外线C 过表达槲皮素 RNA干扰 Western-blot 单细胞琼脂糖凝胶电泳实时定量荧光PCR
分类号: R114
类　型: 博士论文
年　份: 2006年
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内容摘要

真核生物和原核生物在高温、接触毒物和其它各种应激因素(如烟碱、一氧化碳、重金属、电离辐射、缺血缺氧等)等有害因素作用时,生物体会迅速启动高度程序化的热休克反应(heat shock response,HSR),诱导合成一组高度保守的热休克蛋白质(heat shock proteins, Hsps)。Hsps是生物界(包括从细菌到人的生物)经过长期进化仍旧保留下来的、对体内外不良因素起保护作用的一类蛋白质。根据Hsps在SDS-PAGE上的结果,按其分子量大小将Hsps分为如下几个家族:大分子HSPs (≥100 kD),HSP90 (81 - 99 kD),HSP70(65 - 80 kD),HSP60(55 - 64 kD),HSP40(35 - 54 kD),小分子HSPs(≤34 kD),其中最为主要和重要的是HSP70家族的Hsp70。许多研究提示了其可能的作用和功能如下:1) Hsp70保护细胞或生物免遭各种应激因素的损害,赋予它们从各种应激中恢复的能力;其中,表现最为明显的是热耐受能力的形成,即当细胞或生物接触亚致死温度后,表现对致死温度的存活率明显增加;2) Hsp70对保护细胞内重要遗传物质DNA可能具有重要作用,且在生物生长、发育和分化过程中也起着重要作用;3) Hsp70与体内许多重要生物活性物质(如类固醇、肿瘤坏死因子等)有着密切的联系,参与体内许多调节过程;4)更重要的是,Hsp70作为分子伴侣,促进蛋白质的合成、折叠、装配和运输,还参与变性蛋白质的清除,这种重要功能可能与热耐受、毒物耐受有关。Hsp70正常时分布在细胞浆,而有害因素应激时则分布在细胞核,且分布于染色体周围,这个重要现象提示了Hsp70在DNA保护中的可能作用与意义。DNA修复是一个重要的研究方向,而大多数研究均只从不同的DNA修复来研究它们的重要作用与机制,但很少同时考虑到DNA损伤,更少考虑到重要蛋白质在DNA损伤与修复平衡中的作用。Hsp70是重要的分子伴侣,参与蛋白质的合成、折叠、装配和运输以及变性蛋白质的清除等,无疑它也可能与DNA损伤和修复相关酶的合成和功能有关。本研究通过构建Hsp70表达升高和降低两种细胞模型,用紫外线C作为DNA损伤剂,利用彗星实验、Western-blot技术、实时定量RT-PCR等方法来观察Hsp70表达不同水平细胞中的DNA损伤和修复情况,来探讨Hsp70在DNA损伤和修复过程的可能作用。本研究共分三部分。第一部分Hsp70过表达及Hsp70表达抑制细胞模型的建立对于Hsp70过表达细胞模型的建立,我们采用pcDNA3.0/hsp70重组质粒进行细胞转染并用G418筛选稳定的Hsp70高表达细胞株(A549/hsp70)。空载体质粒pcDNA3.0转染细胞作为平行转染对照(A549/pcDNA)。对于Hsp70表达抑制细胞模型的建立我们用了槲皮素抑制Hsp70表达和RNA干扰技术两种方法并进行了比较。槲皮素(quercetin)是一种广泛存在的生物黄酮类物质,可以抑制某些肿瘤细胞Hsp70的合成,使细胞Hsp70表达降低。我们首先采用不同浓度槲皮素(50、100、150、200μmol/L)处理A549细胞6h,用MTT实验和Western-blot技术检测槲皮素处理后的A549细胞中Hsp70蛋白的表达。结果发现,随槲皮素浓度的增加,A549细胞的Hsp70的表达呈下降趋势,50μmol/L槲皮素处理Hsp70表达未见显著下降(P > 0.05)、100μmol/L处理组Hsp70表达显著降低(P < 0.05),150μmol/L和200μmol/L处理组Hsp70表达显著降低(P < 0.01);结合MTT实验,最终确定150μmol/L槲皮素处理6h来作为Hsp70表达抑制的模型(A549/quercetin),0.01%的DMSO处理作为溶剂对照(A549/DMSO)。RNA干扰是近年来发展起来的一种研究基因功能的新方法。将NPY-1、NPY-2、NPY-3和NPY-4四种质粒瞬时转染A549细胞,48h后分别用RT-PCR和Western-blot技术检测其mRNA和蛋白质的表达。结果发现,NPY-4相对于其它三种质粒子,能有效干扰A549细胞中Hsp70表达,与A549组相比,NPY-4质粒转染组Hsp70mRNA水平下降34.07%,Hsp70蛋白相对表达下降14.23%。但与150μmol/L槲皮素处理6h相比,抑制Hsp70表达的效率较低。综合比较,最终选用150μmol/L槲皮素处理A549细胞6h来作为抑制Hsp70表达的细胞模型。最后我们对Hsp70高表达和表达抑制的细胞模型进行了鉴定。利用细胞免疫荧光技术和Western-blot技术检测了各细胞中的Hsp70的表达。细胞免疫荧光结果发现A549/quercetin组细胞的荧光强度明显低于正常培养的A549组细胞,而A549/hsp70组细胞的胞浆内荧光强度明显高于正常培养的A549组细胞,Hsp70水平相对较多;Western-blot检测发现,与A549组相比,A549/quercetin组Hsp70表达明显降低(P﹤0.01),A549/hsp70组Hsp70表达明显增加(P﹤0.01),A549/DMSO和A549/pcDNA组Hsp70的表达未见明显变化(P > 0.05)。第二部分Hsp70在紫外线致DNA损伤中的作用为阐明紫外线照射不同Hsp70表达后A549细胞DNA损伤的情况,本研究应用MTT试验、彗星试验(单细胞琼脂糖凝胶电泳),检测了紫外线C(UVC)照射不同剂量(10、20、40和80 J/m2)对A549、A549/quercetin和A549/hsp70细胞引起DNA损伤的Olive尾矩。结果表明随着紫外线照射剂量的增加,无论在A549组、A549/quercetin组,还是在A549/hsp70组, DNA损伤的Olive尾矩均呈上升趋势。与A549组相比,在UVC照射剂量为10 J/m2时A549/DMSO组和A549/pcDNA组Olive尾矩未见明显差异(P > 0.05), A549/quercetin组Olive尾矩明显增加(P < 0.05),A549/hsp70组Olive尾矩明显减少(P < 0.05);在20 J/m2时,A549/quercetin组Olive尾矩明显增加(P < 0.05),A549/hsp70组Olive尾矩明显减少(P < 0.05);与A549组、A549/DMSO组相比,A549/quercetin组彗星率增加,但差异没有显著性差异(P > 0.05);但是在40J/m2时,A549/quercetin组Olive尾矩明显增加(P < 0.05),A549/hsp70组Olive尾矩明显减少(P < 0.01);在80 J/m2时,A549/quercetin组Olive尾矩明显增加(P < 0.05),A549/hsp70组Olive尾矩明显减少(P < 0.05)。由此可见,Hsp70参与了UVC造成的DNA损伤过程,它可以对抗一定范围内的UVC造成的的DNA损伤。这可能与作为分子伴侣的Hsp70可以帮助变性受损的蛋白质复性或降解有关,高表达Hsp70充分发挥分子伴侣作用,保持细胞内稳态,减轻细胞的损伤。第三部分Hsp70在紫外线致主要核苷酸切除修复酶mRNA变化中的作用为了进一步探讨Hsp70在DNA修复过程中的作用,利用实时定量RT-PCR技术检测了UVC照射不同剂量(10、20、40和80 J/m2)对A549、A549/quercetin和A549/hsp70细胞中核苷酸切除修复途径上DNA修复酶XPA、XPC、XPB、XPF、XPG和ERCC1基因mRNA的表达,同时观察了Hsp70蛋白水平和DNA核苷酸切除修复酶mRNA表达的相关关系。结果显示:XPA mRNA结果显示:随紫外线照射剂量增加,与未处理组细胞相比,XPA mRNA表达呈升高趋势。以不同细胞分组,与未处理组相比,A549组在10 J/m2时未见明显变化,20 J/m2、40 J/m2和80 J/m2时,分别升高至1.7、5.26和6.06倍;A549/DMSO组、A549/pcDNA组和A549/quercetin组与A549组XPA mRNA表达的变化趋势一致;而A549/hsp70组在≤40 J/m2时未见明显变化,到80 J/m2时,XPA mRNA表达升高,相当于A549细胞未处理组的7.1倍。在同一剂量下,XPA mRNA表达与A549组相比,0 J/m2、10 J/m2及80 J/m2时,各细胞组之间无显著性差异(P > 0.05);A549/hsp70组在20 J/m2时XPA表达降低,但未见显著性差异增加(P > 0.05),40 J/m2时显著降低(P < 0.05)。XPC mRNA结果显示:紫外线照射处理后,各细胞组与未处理A549组细胞相比,XPC mRNA的表达均降低。在A549细胞组,从10 J/m2时开始降低,到80 J/m2时分别降低到0.16、0.25、0.46和0.69倍。A549/DMSO组和A549/pcDNA组XPCmRNA表达变化规律与A549组细胞一致。在A549/quercetin组,从10 J/m2时降低,到80 J/m2时分别降低到0.52、0.52、0.31和0.34倍。在A549/hsp70组,从10 J/m2、20 J/m2和80 J/m2时分别降低为0.39、0.74和0.89倍。在同一剂量下,XPC mRNA表达与A549组相比,0 J/m2时,A549/quercetin组和A549/hsp70组随有升高,但未见显著性差异(P > 0.05);在10 J/m2时,A549/DMSO组、A549/pcDNA组和A549/hsp70组之间无显著性差异(P > 0.05),A549/quercetin组、A549/hsp70组表达升高但未见显著性差异(P > 0.05),A549/hsp70组在20 J/m2表达升高但未见显著性差异(P > 0.05);在40 J/m2时,A549/hsp70组表达明显升高(P < 0.01),与A549/quercetin组相比,A549/hsp70组表达明显升高(P < 0.01);在80 J/m2时, A549/quercetin组表达降低、A549/hsp70组表达升高未见显著性差异(P > 0.05)。XPB mRNA结果显示:随紫外线照射剂量增加,与未处理组细胞相比,XPB mRNA表达变化,在A549组,10 J/m2时开始降低为0.85倍,到20 J/m2、40 J/m2和80 J/m2时,分别降低为0.33、0.33和0.34倍;A549/DMSO组和A549/pcDNA组与A549组XPB mRNA表达的变化与A549组一致;A549/quercetin组在10 J/m2时升高为5.74倍,20 J/m2时升高为1.25倍,40 J/m2和80 J/m2分别升高2.43和29倍;在A549/hsp70组,10 J/m2时开始降低,为未处理组的0.35倍,在20 J/m2、40 J/m2和80 J/m2时分别为未处理组的0.6、0.52和0.51倍。在同一剂量下,XPB mRNA表达与A549组相比,0 J/m2时,各细胞组之间无显著性差异(P > 0.05);在10 J/m2时,与A549组相比,A549/DMSO组和A549/pcDNA组之间无显著性差异(P > 0.05),A549/quercetin组表达明显升高(P < 0.01),与A549/hsp70组相比表达明显升高(P < 0.01);在20 J/m2时,与A549组相比,A549/DMSO组和A549/pcDNA组之间无显著性差异(P > 0.05),A549/quercetin组表达明显升高(P < 0.01),与A549/hsp70组相比,A549/quercetin组表达明显升高(P < 0.01);在40 J/m2时,与A549组相比,A549/DMSO组和A549/pcDNA组之间无显著性差异(P > 0.05),A549/quercetin组表达明显升高(P < 0.01),与A549/hsp70组相比,A549/quercetin组表达明显升高(P < 0.01);在80 J/m2时,与A549组相比,A549/DMSO组和A549/pcDNA组之间无显著性差异(P > 0.05),A549/quercetin组表达明显升高(P < 0.01),与A549/hsp70组相比,A549/quercetin组表达明显升高(P < 0.01)。XPF mRNA结果显示:随紫外线照射剂量增加,除A549/hsp70组外,其它各细胞组XPF mRNA表达均降低。在A549组,从10 J/m2到80 J/m2分别降低为0.6、0.51、0.46和0.57倍;A549/DMSO组和A549/pcDNA组与A549组XPF mRNA表达的变化与A549组基本一致;A549/quercetin组从10 J/m2到80 J/m2分别降低为0.48、0.31、0.16和0.63倍;A549/hsp70组,XPF mRNA表达在10 J/m2时开始降低为0.6倍,然后又逐步开始升高,在40 J/m2和80 J/m2时分别为A549未处理组的1.63和1.75倍。在同一剂量下,XPF mRNA表达与A549组相比,0 J/m2、10 J/m2和20 J/m2时,各细胞组之间无显著性差异(P > 0.05);在40 J/m2时,与A549组相比,A549/quercetin组表达降低,但无显著性差异(P > 0.05),A549/hsp70组明显增高(P < 0.01),与A549/quercetin组相比,A549/hsp70组表达明显降低(P < 0.01);在80 J/m2时,与A549组相比,A549/quercetin组表达降低但无显著性差异(P > 0.05),A549/hsp70组明显增高(P < 0.01),与A549/quercetin组相比,A549/hsp70组表达明显降低(P < 0.01)。XPG mRNA结果显示:在紫外线照射的各剂量组,与未处理组细胞相比,除A549/hsp70组,其它各组XPG mRNA表达均降低。在A549组,10 J/m2时开始降低,为未处理组的0.38倍,20 J/m2、40 J/m2、80 J/m2时分别为未处理组的0.32、0.65和0.74倍;A549/DMSO组和A549/pcDNA组与A549组XPG mRNA表达的变化与A549组一致; A549/quercetin组在10 J/m2时开始降低,为未处理组的0.5倍,20 J/m2、40 J/m2、80 J/m2时分别为未处理组的0.97、0.67和0.89倍;在A549/hsp70组,从10 J/m2时开始升高,为未处理组的1.28倍,20 J/m2时又降低为未处理组的0.69倍,在40 J/m2和80 J/m2时又升高,分别为为未处理组的1.41和1.81倍。在同一剂量下,XPG mRNA表达与A549组相比,0 J/m2时,各细胞组之间无显著性差异(P > 0.05);在10 J/m2时,A549/DMSO组、A549/pcDNA组和A549/quercetin组之间无显著性差异(P > 0.05),A549/hsp70组表达明显升高(P < 0.05),与A549/quercetin组相比,A549/hsp70组表达明显升高(P < 0.05);在20 J/m2时,各组间未见显著性差异(P > 0.05);在40 J/m2和80 J/m2时,A549/hsp70组表达明显升高(P < 0.05),与A549/quercetin组相比,A549/hsp70组表达明显升高(P < 0.05)。ERCC1 mRNA结果显示:随紫外线照射剂量增加,与未处理组细胞相比,ERCC1 mRNA表达变化呈降低趋势;在A549组,从10 J/m2到80 J/m2分别降低为0.35、0.47、0.52和0.57倍;A549/DMSO组和A549/pcDNA组与A549组ERCC1 mRNA表达的变化与A549组一致;A549/quercetin组从10 J/m2到80 J/m2分别降低为0.28、0.38、0.39和0.48倍;在A549/hsp70组,从10 J/m2到80 J/m2分别降低为0.68、0.51、0.69和0.86倍。在同一剂量下,ERCC1 mRNA表达与A549组相比,0 J/m2时,各细胞组之间无显著性差异(P > 0.05);在10 J/m2时,A549/DMSO组和A549/pcDNA组无显著性差异(P > 0.05),A549/quercetin组虽然降低但无显著性差异(P > 0.05),A549/hsp70组表达明显升高(P < 0.05),与A549/quercetin组相比,A549/hsp70组表达明显升高(P < 0.01);在20 J/m2、40 J/m2和80 J/m2时,A549/quercetin组均降低但无显著性差异(P > 0.05),A549/hsp70组均升高但无显著性差异(P > 0.05)。另外,我们通过瞬时转染含虫荧光素酶报告基因的pCMVluc质粒,40h后检测宿主细胞对损伤质粒DNA的修复情况,根据宿主细胞表达荧光物质的含量来评估宿主细胞的DNA整体修复能力,为人群流行病学检测大样本的DNA修复能力提供一些实验依据。综上所述,本研究结果表明:(1)确定了槲皮素抑制A549细胞Hsp70表达的最佳剂量,150μmol/L的槲皮素可以有效抑制A549细胞Hsp70表达;采用含hsp70基因cDNA重组质粒进行细胞转染并经筛选建立了稳定的Hsp70过表达细胞株。(2)初步筛选了RNAi抑制Hsp70的有效序列(5’- CTT ATG AAC CAC TTT GAT TTG C-3’)。(3)Hsp70可以减轻紫外线C中低剂量(≤40 J/m2)引起的A549细胞DNA损伤。(4)紫外线C照射Hsp70表达抑制和Hsp70过表达细胞后的核苷酸切除修复过程中的DNA修复基因mRNA表达变化为:XPA表达在紫外线照射40 J/m2时,A549/hsp70组表达明显降低而A549/quercetin组未见明显降低;XPC表达在20 J/m2和40 J/m2时紫外线照射时,A549/hsp70组明显升高,而A549/quercetin组未见变化;XPB表达在紫外线照射的各剂量组,A549/quercetin组明显升高,A549/hsp70组与A549组相比未见显著性差异;XPF在紫外线照射的高剂量时,A549/hsp70组表达明显升高;XPG在紫外线照射的高剂量时,A549/hsp70组表达明显升高;ERCC1在紫外线照射低剂量时,A549/hsp70组表达明显升高。(5)UVC照射下,Hsp70蛋白与DNA核苷酸切除修复酶基因XPA、XPB、XPF、XPG、ERCC1 mRNA表达之间存在相关关系,而Hsp70蛋白与XPC mRNA表达之间未发现相关关系。本研究的创新之处在于:(1)同时使用了Hsp70升高和降低的细胞模型,为探讨Hsp70的功能提供有力的依据,可以从正反两个方面同时验证Hsp70的功能和作用;(2)同时考虑到了Hsp70在DNA的损伤和修复过程中的作用,而不是单纯的损伤或修复。本课题有待深入研究的方面有:(1)关于Hsp70表达抑制的模型,应该进一步用特异性的手段。针对RNAi技术存在的一些问题加以改进,比如继续筛选更加有效的siRNA序列、通过稳定转染筛选低Hsp70表达稳定的细胞株来进行实验;(2)Hsp70与DNA修复的关系还有待于进一步的研究和探索,尤其是Hsp70参与DNA修复的具体机制还有待于证实;(3)可以通过激光共聚焦、染色质免疫沉淀等方法来检测Hsp70蛋白与DNA修复酶之间的交互作用;(4)DNA整体修复能力的测定如何应用于人群现场流行病学调查,如何应用于职业性有害因素对机体DNA损伤修复的评价,还需要进一步的探讨。

全文目录

英文缩写  6-8
摘要  8-16
ABSTRACT  16-21
前言  21-25
第一部分 Hsp70 过表达及 Hsp70 表达抑制细胞模型的建立  25-47
  Ⅰ Hsp70 过表达的体外研究  25-29
    1.1 材料和方法  25-26
    1.2 结果  26-27
    1.3 讨论  27-29
  Ⅱ槲皮素抑制 HSP70 表达的体外研究  29-35
    2.1 材料和方法  29-32
    2.2 结果  32-33
    2.3 讨论  33-35
  Ⅲ应用 RNA 干扰抑制 HSP70 表达的体外研究  35-43
    3.1 材料和方法  35-39
    3.2 结果  39-41
    3.3 讨论  41-43
  Ⅳ HSP70 表达的鉴定  43-47
    4.1 材料和方法  43-44
    4.2 结果  44-45
    4.3 讨论  45-47
第二部分 Hsp70 在紫外线致 DNA 损伤中的作用  47-54
  1 材料和方法  47-49
  2 结果  49-52
  3 讨论  52-54
第三部分 HSP70 在紫外线致主要核苷酸切除修复酶 MRNA 变化中的作用  54-80
  ⅠHSP70 在紫外线致核苷酸切除修复酶 MRNA 变化中的作用  54-73
    1.1 材料和方法  55-58
    1.2 结果  58-70
    1.3 讨论  70-73
  Ⅱ宿主细胞复活试验检测 DNA 修复能力方法的建立  73-80
    2.1 材料和方法  73-76
    2.2 结果  76-78
    2.3 讨论  78-80
总结  80-82
参考文献  82-91
综述: RNA 干扰研究进展及其在职业医学领域的应用前景  91-105
博士研究生期间工作小结  105-107
致谢  107

热休克蛋白70在紫外线致DNA损伤与修复中的作用

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