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扶正抗艾方对免疫抑制小鼠免疫调节和CC、CXC类趋化因子的影响研究

作　者: 刘静
导　师: 赵映前
学　校: 湖北中医学院
专　业: 中医临床基础
关键词: 扶正抗艾方免疫抑制动物模型免疫调节趋化因子
分类号: R285.5
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

目的艾滋病是以全身免疫系统严重损害为特征的致死性疾病，病死率极高，故艾滋病的防治是国际性的重大课题。由于艾滋病病毒的易变性，且缺乏适当的动物模型，致使疫苗研制面临很大困难，防治艾滋病的药物研究进展缓慢。目前西医对艾滋病的治疗包括全身疗法、抗机会性感染、抗继发性肿瘤和抗HIV的综合治疗。由于艾滋病阶段每日HIV复制达上百亿，破坏宿主细胞上百万，因此如何抑制乃至消灭人体内HIV，一直是人们高度关注的焦点。虽然抗艾滋病药能使病毒载量大幅度下降，但不能完全清除，停药后易反弹；药物的不良反应较多并容易产生耐药性；药物价格虽然已大幅度下降，但由于终生用药而不能承受，这些仍是有待解决的重要问题。在这种形势下，中医药学引起了人们的关注。扶正抗艾方是在湖北省中医院承担的国家六五-九五攻关课题“中医药防治病毒性肝炎”的处方基础上筛选组方。其主要药物组成有黄芪、党参等，具有扶助正气、祛瘀解毒等作用，并以扶正为主，体现了中医治病防病的观点：“正气存内，邪不可干”。本课题观察扶正抗艾方对免疫抑制小鼠外周血淋巴细胞Lymph计数、CD4百分数值、CD8百分数值、CD4／CD8，血清、脾脏悬液、胸腺悬液中白介素2(IL-2)、γ干扰素(IFN-γ)含量、趋化因子正常T细胞分泌激活因子(RANTES)、基质细胞衍生因子(SDF-1)、巨噬细胞炎症蛋白1-α(MIP1-α)含量，胸腺、脾脏指数及超微结构，脾脏中RANTES-mRNA表达的影响，探讨本方对免疫抑制小鼠免疫功能提高的机理，为拓宽本方的临床应用和药物开发提供科学的理论依据。方法BALB／C小鼠80只，雄性，随机分8组(正常对照组一、正常对照组二、模型对照组一、模型对照组二、中药高、中、低剂量组、西药对照组)，除正常对照组外，余6组均用氢化可的松HC造模，25mg／只／天，连续腹腔注射7天后，取正常对照组一和模型对照组一小鼠，称重(g)后摘眼球取血测外周血淋巴细胞计数，摘胸腺和脾脏称湿重并计算脏器指数(胸腺、脾脏湿重mg／体重g)，以检测造模成功与否，若模型对照组鼠外周血淋巴细胞计数、脏器指数与正常对照组比较有差异(P＜0.05)，说明造模成功。造模成功以后，模型对照组、中药高、中、低剂量组、西药对照组用20mg／只／天维持四周；同时所有鼠用0.4ml／只／天的剂量灌胃4周(正常对照组、模型对照组灌服生理盐水，中药组分高、中、低三个剂量灌服扶正抗艾方，西药对照组灌服香菇菌多糖片)。末次灌胃6小时后，摘眼球取血，检测其外周血Lymph计数，流式细胞法检测CD4、CD8百分数值及比值；摘取脏器胸腺、脾脏，酶联免疫吸附实验(ELISA)法检测鼠血清、脾脏悬液、胸腺悬液中IL-2、IFN-γ、趋化因子RANTES、SDF-1、MIP1-α的蛋白表达；称小鼠体重及胸腺、脾脏的湿重，计算小鼠胸腺、脾脏指数，电镜下观察胸腺、脾脏超微结构；逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测脾脏中RANTES-mRNA表达。结果(1)正常对照组和模型对照组外周血中Lymph计数，脾脏和胸腺指数(脾脏、胸腺重量mg／鼠重量g)比较有非常显著性差异P＜0.01，说明免疫抑制小鼠模型造模成功。(2)外周血淋巴细胞Lymph计数模型对照组与中、西药治疗各组比较均有显著性差异P＜0.05，说明扶正抗艾方各剂量组和香菇菌多糖组均能够增加免疫抑制小鼠外周血淋巴细胞计数，中药中剂量组效果最明显。(3)外周血CD4、CD8百分数值及CD4／CD8，模型对照组与正常对照组比较有显著性差异P＜0.05，说明HC能抑制T淋巴细胞中CD4、CD8两个亚群的数量；中药中、低剂量组、香菇菌多糖组与模型对照组比较有显著性差异P＜0.05，说明中药中、低剂量组、香菇菌多糖组能增加T淋巴细胞中CD4、CD8两个亚群的数量，尤其是CD4的数量和，CD4／CD8。(4)胸腺悬液中IL-2、IFN-γ的OD值模型对照组与正常对照组比较有显著性差异P＜0.05，说明HC能抑制免疫器官胸腺中IL-2、IFN-γ的分泌；中药中、低剂量组、香菇菌多糖组与模型对照组比较有显著性差异P＜0.05，说明中药中、低剂量组、香菇菌多糖组能增加胸腺中IL-2、IFN-γ的分泌；脾脏悬液中IL-2、IFN-γ的OD值模型对照组与正常对照组比较有显著性差异P＜0.05，说明HC能抑制免疫器官脾脏中IL-2、IFN-γ的分泌；中药中剂量组、香菇菌多糖组与模型对照组比较有显著性差异P＜0.05，说明中药中剂量组、香菇菌多糖组能增加胸腺中IL-2、IFN-γ的分泌；血清中IL-2、IFN-γ的OD值模型对照组与正常对照组比较有显著性差异P＜0.05，说明HC能抑制外周血中IL-2、IFN-γ的分泌；中药中剂量组、香菇菌多糖组与模型对照组比较有显著性差异P＜0.05，说明中药中剂量组和香菇菌多糖组能增加外周血中IL-2、IFN-γ的分泌。(5)小鼠脾脏、胸腺指数(脾脏、胸腺重量mg／鼠重量g)模型对照组与正常对照组比较有非常显著性差异P＜0.01，说明HC能抑制免疫器官中细胞的数量和重量；中药中剂量组与模型对照组比较有非常显著性差异P＜0.01，说明中药中剂量组能恢复免疫细胞的数量、体积；电镜观察脾脏与胸腺的超微结构见正常对照组的脾脏与胸腺中淋巴细胞结构清晰、正常，免疫抑制模型对照组的脾脏与胸腺淋巴细胞数量减少，结构明显差异，淋巴细胞染色质变浅，免疫抑制组小鼠脾脏、胸腺细胞数量同倍数视野下与正常对照组比较明显减少，细胞器形态结构异常，如核、浆比例增大，核固缩，线粒体空泡化，有个别胞核分裂等，通过使用中药中剂量后，这种变化有不同程度的改善，如细胞数量变多，细胞器增加，线粒体结构清晰，功能表现有恢复现象等。(6)小鼠血清、脾脏悬液、胸腺悬液中趋化因子RANTES蛋白表达的OD值模型对照组与正常对照组比较有显著性差异P＜0.05，说明免疫抑制小鼠外周血及免疫器官中RANTES的表达减少；中药中剂量组与模型对照组比较有显著性差异P＜0.05，说明中药中剂量组能增加外周血及免疫器官中趋化因子RANTES的蛋白表达；SDF-1、MIP-1α含量各组间无差异。(7)电泳结果表明，RANTES基因相对表达量正常对照组＞模型对照组，中药高剂量组＞中药中、低剂量组、香菇菌多糖组＞模型对照组，说明中药各剂量组和香菇菌多糖组均能不同程度增加RANTES的基因表达；半定量分析表明中药高、中剂量组增能加小鼠脾脏中RANTES的基因表达。结论(1)中剂量的“扶正抗艾”方对于T淋巴细胞亚群CD4、CD8的百分数值及CD4／CD8有明显的升高调节作用，能够明显提高CD4的百分数值含量及CD4／CD8的比值，说明本方能提高免疫抑制小鼠机体的细胞免疫功能；(2)“扶正抗艾”方各剂量组及香菇菌多糖组均能够诱生免疫抑制小鼠模型血清中和免疫脏器悬液中的IL-2和IFN-γ含量，中药中剂量组效果更显著；通过IL-2和IFN-γ的分泌增多，可提高患者体内T细胞的数量和功能，增强免疫功能；(3)“扶正抗艾方”对氢化可的松所致免疫功能低下小鼠脾脏、胸腺重量指数有明显的提高作用，能够改善免疫抑制小鼠脾脏、胸腺超微结构，说明本方从淋巴细胞形态结构、数量、体积各方面都具有免疫提高作用；(4)免疫抑制小鼠免疫器官脾脏中RANTES的基因表达减少，“扶正抗艾”中药复方能增强其在免疫器官及外周血中的表达，尤其是高剂量组，通过竞争性结合CCR5，阻断R5噬性病毒株的进入，从而抑制HIV的感染，有助于机体提高抗HIV的能力或者延缓疾病的发展过程。

全文目录

中文摘要  5-9
英文摘要  9-14
名词术语中英文对照表  14-15
前言  15-17
第一部分:实验研究  17-49
  实验一扶正抗艾方对免疫抑制小鼠外周血Lymph、CD4、CD8的影响  17-26
    1 实验材料  17
    2 实验方法与结果  17-21
    3 讨论  21-24
    参考文献  24-26
  实验二扶正抗艾方对免疫抑制小鼠血清、脾脏悬液、胸腺悬液中IL-2、IFN-γ蛋白表达的影响  26-32
    1 实验材料  26
    2 实验方法与结果  26-28
    3 讨论  28-31
    参考文献  31-32
  实验三扶正抗艾方对免疫抑制小鼠胸腺、脾脏指数及超微结构的影响  32-36
    1 实验材料  32
    2 实验方法与结果  32-34
    3 讨论  34-35
    参考文献  35-36
  实验四扶正抗艾方对免疫抑制小鼠血清、脾脏悬液、胸腺悬液中趋化因子RANTES、SDF-1、MIP1-α蛋白表达的影响  36-42
    1 实验材料  36
    2 实验方法与结果  36-39
    3 讨论  39-41
    参考文献  41-42
  实验五扶正抗艾方对免疫抑制小鼠脾脏中RANTES-mRNA表达的影响  42-49
    1 实验材料  42-43
    2 实验方法与结果  43-46
    3 讨论  46-47
    参考文献  47-49
第二部分:总结与讨论  49-64
  1 中医对艾滋病病因病机的认识  49-51
  2 现代医学对艾滋病的认识  51-54
  3 CC、CXC类趋化因子与艾滋病的相关性  54
  4 中医扶正培本与现代免疫相关性的探讨  54-55
  5 实验模型与艾滋病所致的免疫抑制低下的相关性  55
  6 扶正抗艾方的组方方解  55-57
  7 研究思路与意义  57
  8 主要研究成果  57-59
  9 结语  59-61
  参考文献  61-64
附图  64-69
综述  69-81
  参考文献  77-81
致谢  81

扶正抗艾方对免疫抑制小鼠免疫调节和CC、CXC类趋化因子的影响研究

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