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早幼粒细胞白血病蛋白和相关因子在肺癌的表达以及临床意义的研究

作　者: 赵志龙
导　师: 赵惠儒
学　校: 中国医科大学
专　业: 胸外科学
关键词: 肺肿瘤 PML bcl-2 P53 P16INK4A Survivin COX-2
分类号: R734.2
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要


研究背景自20世纪70年代以来，中国的恶性肿瘤发病率和病死率呈明显上升趋势，现已成为我国城乡居民的首要死因。其中，肺癌发病率和病死率的上升趋势尤为明显，虽然以手术为主的多学科综合治疗以及个体化治疗的进步，其病死率位列所有恶性肿瘤之首，早期发现和早期治疗仍然被认为是治疗这类恶性疾病的主要策略。PML（promyelocytic leukemia）基因是在对急性早幼粒细胞白血病（APL）发病机制的研究中被发现，被认为在所有APL的发生发展过程中出现变异。通过对APL以及包括肝癌、乳腺癌、膀胱癌和前列腺癌等在内的实体肿瘤的研究中，PML蛋白表现出具有调节细胞分化、诱导凋亡和老化的重要作用。利用腺病毒把PML基因转染四种不同肝癌细胞后，高表达PML蛋白首先诱导全部四种细胞在G1期出现细胞周期停滞，然后引发广泛细胞死亡。随着时间延长，其诱导细胞死亡的效力甚至大于转染p53的作用。PML基因与肺癌发生发展的关系不清。通过在美国Pubmed和中国CNKI数据库的检索，关于肺癌和PML基因的研究寥寥3篇，样本量较少（共87例），并且缺乏临床和预后相关性的分析。为此我们通过构建包含正常肺组织、肺良性肿瘤和肺癌的组织芯片，探究PML、P53、P16INK4A、Bcl-2、Survivin和Cox-2蛋白在这些组织的表达以及与临床预后之间的关系。方法1、标本来源1998年1月1日至2000年6月30日，在中国医科大学第一医院胸外科手术治疗的肺癌患者148例，手术前未行放化疗，同期肺良性肿瘤5例、肺正常组织7例，共计160例。手术标本构建组织芯片，其中有4例肺癌组织因为取样失误以及免疫组织化学染色后脱片被排除。2、组织芯片的质检使用兔抗人COX-2单克隆抗体对组织芯片与普通切片进行免疫组化S-P法染色，验证组织芯片与大体切片的符合率；3、免疫组织化学染色方法利用组织芯片进行免疫组化染色，检测PML、P53、P16INK4A、Bcl-2、Survivin和Cox-2的表达，分析相互间的相关性，以及同临床特点和预后的联系；4、提取RNA进行RT-PCR筛选40例PML蛋白无表达石蜡包埋肺癌组织（保存时间在60～85个月，平均69个月），利用Trizol一步法提取总RNA，与新鲜肺癌组织中提取的RNA进行比较，并利用RT-PCR检验PML基因转录情况。5、统计方法数据分析利用SPSS 13.0统计软件完成，P＜0.05为具有统计学意义。阳性率比较采用列联表法，若例数（N）＞40，且最小期望频数（n）＞1，使用Pearson卡方检验进行统计；若N＞40，1＜n＜5时使用连续校正卡方检验；若N≤40，或n＜1，应用Fisher检验；相关性分析采用Spearman相关性检验；Kaplan-Meier法用来估计生存差异，组间比较应用Log rank和Breslow检验；Cox比例风险模型用来进行单因素和多因素生存分析，生存分析以pTNM分期（Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ）进行分层。结果1、组织芯片质检结果在切片和染色后组织芯的脱片率＜3％。COX-2在普通切片的阳性率为55％（33／60），组织芯片中4个和3个点的阳性率都为53.3％（32／60），2个和1个点的阳性率分别为50％（30／60）、46.7％（28／60）。COX-2在普通切片的阳性率同组织芯片1至4个点的差异无统计学意义。2、各因子表达结果和意义144例肺癌中，PML于细胞核着色40例、浆着色26例，细胞浆、核共表达12例；其中，NSCLC和SCLC细胞核表达率分别为31.4％和8.7％（P=0.026）；NSCLC和SCLC的PML细胞浆表达率分别为14％和39.1％（P=0.01）。良性肿瘤中，PML强表达于两例肺平滑肌瘤的细胞核：肺癌中PML表达多为弱阳性（46／54）；PML表达的SCLC病人5年累积生存率50％（中位54个月），高于阴性表达病人的23％（中位13个月），差异有显著性。Cox单因素和多因素分析均显示PML是SCLC病人预后的独立影响因素。P53在肺癌的阳性率为33.3％（48／144），在肺良性肿瘤和正常肺组织无表达（P=0.038）。NSCLC和SCLC的P53表达率分别为33.1％（40／121）和34.8％（8／21），其中，正常肺组织和肺良性肿瘤与NSCLC比较，差异有显著性（P=0.040）；而与SCLC比较差异有临界显著性（P=0.057）。P16INK4A在肺癌中表达率为28.5％（41／144），正常肺组织和肺良性肿瘤P16<sup>INK4A阳性率为8.3％（1／12），仅有一例肺平滑肌瘤弱表达，P16INK4Am在SCLC高表达，表达率为69.6％（16／23），在NSCLC的为20.7％（25／121）；此外，高度或中度分化肿瘤的P16INK4A表达率为20％，低度或未分化肿瘤的为36.5％（P=0.028）。Survivin在肺癌的阳性率为90.3％（130／144），正常肺组织和肺良性肿瘤的阳性率为58.3％（7／12）（P=0.005）；NSCLC的Survivin表达率为91.7％，SCLC的82.6％；此外，病人年龄在60岁以下肺癌中，Survivin的表达率明显增高（95.3％vs．83.1％，P=0.015）。Bcl-2在肺癌高表达，表达率为52.8％（76／144），而在肺正常组织和良性肿瘤低表达，阳性率为16.7％（2／12，P=0.016）；鳞癌的Bcl-2表达明显高于腺癌（86.7％vs．27.4％，P＜0.001）。COX-2在肺癌的阳性率为61.8％（89／144），而在肺正常组织和良性肿瘤为25％（3／12，P=0.029）；在NSCLC的表达率为66.9％，在SCLC的表达率为34.8％（P=0.004）；女性、中高度分化、不吸烟病人肺癌中COX-2的表达率显著增高；与鳞癌相比，腺癌中COX-2的表达率增高（79％vs．48.9％，P=0.001）。144例肺癌中，PML与Survivin正相关（P＜0.001，r=0.313），PML细胞核表达同P16负相关，P53与P16、Bcl-2正相关，COX-2与Survivin正相关，但与Bcl-2负相关。NSCLC中，PML与Survivin正相关（P=0.003，r=0.266），P53与Bcl-2正相关，COX-2与Survivin正相关，而同Bcl-2负相关：腺癌中，PML与Survivin的表达正相关（P=0.039，r=0.263），P53与P16、Bcl-2正相关，COX-2与Survivin正相关；鳞癌中，PML与P53和Bcl-2均负相关，COX-2与Survivin正相关；SCLC中，各种因子之间未呈现相关性。3、RNA提取结果和PML mRNA表达情况自新鲜冰冻组织和石蜡包埋组织提取RNA的OD260／OD280范围在1.9～2.1；RNA提取质量电泳图显示：与新鲜冰冻肺癌组织总RNA清楚表现的18S和28S条带相比，FPE肺癌组织的RNA分布广泛，核酸大小在50～450bps，平均为190bps。在40例PML蛋白无表达的肺癌组织中，均获得PMLmRNA表达。结论1、组织芯片是分子生物学研究的可靠工具，具有高通量、省时、快速，同时便于设计大样本实验对照。2、PML作为重要的肿瘤抑制因子，可能成为SCLC有用的生物标记物，在靶向治疗中发挥作用。3、这组肺癌中，PML同Survivin、Bcl-2、P16和突变型P53的表达存在相关性，但未发现同PML有任何联系。4、利用Trizol一步法从石蜡包埋组织提取的RNA纯净度较高，但是用来扩增的目标基因长度不易超过400bp；肺癌组织中PML蛋白无表达不是由于转录下调所致。

全文目录


一、摘要  5-15
  中文论著摘要  5-9
  英文论著摘要  9-15
二、英文缩略语  15-16
三、论文  16-55
  论文一 组织芯片的制作与质检  16-25
    前言  16
    材料方法  16-19
    结果  19-20
    讨论  20-25
  论文二 PML、P53、P16~(INK4A)、Bcl-2、Survivin和Cox-2在肺癌中的表达以及临床意义  25-48
    前言  25
    材料方法  25-27
    结果  27-35
    讨论  35-48
  论文三 从石蜡包埋肺癌组织提取RNA检测PML基因转录情况  48-55
    前言  48
    材料方法  48-51
    结果  51-52
    讨论  52-53
    结论  53-55
四、本研究创新性的自我评价  55-56
五、参考文献  56-66
六、附录  66-92
  综述  66-90
  在学期间科研成绩  90-91
  致谢  91-92
  个人简历  92

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 呼吸系肿瘤 > 肺肿瘤
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