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PttKN1基因在矮牵牛和拟南芥中的遗传转化及其功能分析

作　者: 胡鑫
导　师: 王新宇；王崇英
学　校: 兰州大学
专　业: 细胞生物学
关键词: PttKN1基因 KNOX基因矮牵牛拟南芥基因转化功能分析
分类号: Q943
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

PttKN1(Populus tremula×tremuloides KNOTTED1)是从一种杂交杨的维管束形成层中分离的，属于第一类KNOX基因家族的基因。第一类KNOX基因家族成员编码的蛋白质作为一种转录因子，业已发现在植物的生长发育过程中扮演重要角色。早期研究表明，第一类KNOX基因家族的成员不仅在分生组织中表达，决定分生组织的命运，同时还控制侧生器官的起始和发育，当其在转基因植物中异位表达时，造成一系列叶型、株型和花型发育的异常，同时维管组织的发育模式也发生改变。为了研究多年生木本植物第一类KNOX基因的功能和探讨导入该基因筛选新、奇、特花卉的可能性，本研究采用根癌农杆菌介导的叶盘转化法和花序浸染法，将来自杨树的PttKN1基因导入了花卉植物矮牵牛和两种不同生态型(Nossen和Landsberg erecta，Ler)的拟南芥基因组中，并从形态、解剖、分子等水平，分析了该基因的异位表达对转基因植物生长发育的影响及其与ERECTA基因的互作机理。其主要结果如下：1．通过农杆菌介导的叶盘转化法共获得了21株PttKN1转基因矮牵牛。根据表型，这些转基因植株被分成了七种类型。RT-PCR法检测证明，其中六种为PttKN1表达阳性植株，其中4种类型的叶花形态发生了明显改变，有一定的观赏价值。通过农杆菌花序浸染法，共获得64株PttKN1转基因拟南芥，其中Nossen生态型29株，根据表型分为2个类型；Ler生态型35个，根据表型为分3个类型。RT-PCR法检测证明，绝大多数为阳性。2．PttKN1基因在矮牵牛中过量表达时，1)叶片变小，叶形变化多样，叶片上有异位分生组织的生成；2)无叶柄，中脉缩短，主脉缩小，次脉加大，脉序改变；3)节间距缩短，植株矮化，严重矮化的植株为矮小簇生状；4)植株失去顶端优势，整个植株呈丛生状；5)花冠变小，花瓣扭曲，花瓣之间出现深裂，花瓣的维管束发育异常，花瓣上出现瘤状突起和刺状突起，颜色加深；6)茎形成层的细胞层数目增多。3．PttKN1基因在Nossen生态型拟南芥中过量表达时，叶片由原来的锯齿型改变为羽状全裂型。缺刻叶的叶柄加宽，叶柄中维管束的间距增大，叶脉模式紊乱，细胞形状改变，体积增大。4．PttKN1基因在Ler生态型拟南芥中过量表达时，叶的背腹极性受到干扰，叶表皮细胞形状异常，叶片生长不对称，并且发生扭曲；叶脉不对称分布；花序数及花蕾数增多。从上述结果可以得出以下结论：1．不同植物有各自不同的叶型发育模式，在不同叶型发育模式的植物中，PttKN1基因的异位表达导致叶片产生不同的缺刻，如在矮牵牛中，叶子由原来的全缘椭圆型变为掌状全裂型；在拟南芥(Nossen生态型)中，叶子由原来的锯齿状长椭圆型变为羽状全裂型。2．PttKN1基因表达能促进花分生组织的发生和活性，因为在ERECTA基因功能缺失的情况下，PttKN1基因的异位表达能够使拟南芥的花序及花蕾数增多。因为花序数及花蕾数是与作物产量有关的重要农艺性状，所以弄清第一类KNOX基因与ERECTA基因的互作机理可能具有一定的应用价值。3．由于PttKN1基因编码的蛋白是一个转录因子，具有使细胞处于未决定状态的能力，而ERECTA基因编码的是一个受体激酶，具有传递细胞信号的作用。所以PttKN1基因的作用可能是产生多能细胞，而ERECTA基因的作用则是协调这些多能细胞的增殖与分化。4．PttKN1基因在维管组织的发育中扮演一定的角色，当其过量表达时导致叶柄加宽，主脉缩小，次脉加大，脉序改变，茎形成层的细胞层数目增多。因此，PttKN1基因对叶型和花冠的影响有可能是通过影响维管束的发育而实现的。

全文目录

摘要  8-10
Abstract  10-12
缩略词表  12-13
第一章前言  13-30
  1.KNOTTED1基因的发现及其功能  13-14
  2.KNOX基因的表达模式  14
  3.KNOX基因在茎顶端分生组织中的作用  14-15
  4.KNOX基因在叶发育中的作用  15-19
  5.KNOX基因在花发育中的作用  19-20
  6.KNOX基因在植物株型发育的作用  20
  7.KNOX基因在维管束形成层和次生生长中的作用  20-21
  8.KNOX蛋白的性质  21-24
    8.1.KNOX蛋白功能区域  21-22
    8.2.KNOX蛋白的运输和定位  22-24
  9.KNOX基因与激素的关系  24-25
    9.1.KNOX基因与细胞分裂素  24
    9.2.KNOX基因与赤霉素  24-25
    9.3.KNOX基因与生长素  25
    9.4.KNOX基因与乙烯  25
  10.KNOX基因的mRNA的选择性拼接  25-27
  11.ERECTA基因的研究概况  27
  12.PttKN1基因的背景  27-28
  13.本研究的目的及意义  28-30
第二章 PttKN1在矮牵牛中的遗传转化及其功能分析  30-41
  1.材料与方法  30-33
    1.1.实验材料  30
    1.2.实验方法  30-33
      1.2.1.农杆菌叶盘法介导的PttKN1基因的遗传转化  30-31
      1.2.2.转基因矮牵牛苗的筛选与移栽  31
      1.2.3.转基因矮牵牛苗的RT—PCR鉴定  31-32
      1.2.4.转基因矮牵牛表型观察  32
      1.2.5.转基因矮牵牛茎的显微结构观察  32-33
      1.2.6.转基因矮牵牛苗叶脉脉序的显微观察  33
  2.实验结果  33-36
    2.1.转基因矮牵牛的分子分析  33-34
    2.2.转基因矮牵牛的株型变化与分析  34
    2.3.转基因矮牵牛的花型变化与分析  34-35
    2.4.转基因矮牵牛的叶型变化与分析  35
    2.5.转基因矮牵牛的叶片中脉上形成异位分生组织  35
    2.6.转基因矮牵牛的叶脉变化与分析  35-36
    2.7.转基因矮牵牛的显微结构变化与分析  36
    2.8.转基因矮牵牛对外源激素的反应  36
  3.讨论  36-41
    3.1.PttKN1基因对转基因矮牵牛叶形发育的影响  36-38
    3.2.PttKN1基因对转基因矮牵牛株型发育的影响  38
    3.3.PttKN1基因对转基因矮牵牛花发育的影响  38-39
    3.4.PttKN1基因对转基因矮牵牛维管束发育的影响  39-40
    3.5.分生组织在转基因矮牵牛叶上的异位形成及其探讨  40
    3.6.结论  40-41
第三章 PttKN1在拟南芥(Nossen)中的遗传转化及其功能分析  41-47
  1.材料与方法  41-44
    1.1.实验材料  41
    1.2.实验方法  41-44
      1.2.1.农杆菌花序浸染法介导的PttKN1基因的遗传转化  41
      1.2.2.转基因拟南芥的筛选与移栽  41
      1.2.3.转基因拟南芥的RT—PCR鉴定  41-43
      1.2.4.转基因拟南芥的表型观察  43
      1.2.5.转基因拟南芥的结构观察  43-44
  2.实验结果  44-45
    2.1.转基因拟南芥的RT-PCR鉴定  44-45
    2.2.转基因拟南芥的叶型变化与分析  45
    2.3.转基因拟南芥的叶脉脉序变化与分析  45
    2.4.转基因拟南芥的异位分生组织的产生  45
  3.讨论  45-47
第四章 PttKN1在Landsberg erecta拟南芥中的遗传转化及其功能分析  47-54
  1.材料与方法  47-50
    1.1.实验材料  47
    1.2.实验方法  47-50
      1.2.1.农杆菌花序浸染法介导的PttKN1基因的遗传转化  47
      1.2.2.转基因拟南芥的筛选与移栽  47
      1.2.3.转基因拟南芥的RT—PCR鉴定  47-49
      1.2.4.转基因拟南芥的表型观察  49
      1.2.5.转基因拟南芥的结构观察  49-50
  2.实验结果  50-52
    2.1.转基因Ler拟南芥的分子鉴定  50-51
    2.2.转基因Ler拟南芥的叶型变化与分析  51
    2.3.转基因Ler拟南芥叶表皮细胞的变化与分析  51
    2.4.转基因Ler拟南芥的株型变化与分析  51-52
  3.讨论  52-54
第五章结论与展望  54-60
参考文献  60-77
图版说明  77-80
图版  80-96
致谢  96-97
在读期间发表论文情况  97

PttKN1基因在矮牵牛和拟南芥中的遗传转化及其功能分析

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