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TGF-β与Ras基因在肝癌细胞上皮细胞—间质细胞转化中的作用及机制

作　者: 马超群
导　师: 王剑明
学　校: 华中科技大学
专　业: 普通外科学
关键词: 上皮细胞-间质细胞转化 Ras基因转化生长因子β1 MMH-D3细胞
分类号: R735.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

目的:本研究通过构建携带Ha-ras基因的慢病毒载体并转染小鼠肝脏多能干细胞,观察在转化生长因子(TGFβ-1)诱导下经Ha-ras转化的小鼠肝脏多能干细胞的细胞形态及其表面粘附分子表达的改变,进而探讨TGFβ-1与Ras基因在肝细胞发生上皮细胞-间质细胞转化(Epithelial–Mesenchymal Transition ,EMT)中的作用及可能机制,通过上述手段构建出体外肝癌细胞侵袭转移模型,为进一步研究肝细胞肿瘤侵袭转移机制奠定了实验基础。方法:化学合成含有v-ha-ras基因的质粒、对其进行扩增纯化抽提和鉴定,携带目的基因的质粒和包装质粒共转染293T细胞,获得重组慢病毒。体外培养MMH-D3小鼠肝细胞,取病毒上清感染MMH-D3细胞,荧光显微镜观察绿色荧光蛋白在靶细胞的表达;用流式细胞仪分离出GFP阳性的细胞传代培养,用RT-PCR和Western blot检测ras基因在MMH-R细胞(表达ras基因的MMH-D3细胞系)中的表达。使用含有TGF-β1的培养基培养MMH-R细胞,隔天更换培养基,培养2-3天后观察细胞形态并拍照,免疫荧光染色观察E-cadherin和β-catenin在MMH-D3细胞、MMH-R细胞及MMH-RT细胞(TGF-β1干预MMH-R细胞形成的细胞系)中的表达。结果:重组慢病毒质粒高效率转染293T细胞,收取慢病毒上清转染MMH-D3细胞,荧光显微镜下可见大量绿色荧光。RT-PCR和Western blot结果显示MMH-R细胞中ras基因和蛋白表达明显增加,与对照组MMH-D3细胞系相比有统计学差异(P<0.05)。光学显微镜下显示,慢病毒转染的MMH-R细胞与正常MMH-D3细胞形态无明显差异,而TGF-β1干预的MMH-RT细胞形态发生明显改变,由上皮样表型的细胞转化为纺锤状成纤维样表型的细胞,即发生了上皮细胞间质细胞转化(EMT)。免疫荧光染色显示,MMH-D3细胞和MMH-R细胞中E-cadherin和β-catenin在胞膜上有大量表达,在胞浆中表达较少;而发生转化的MMH-RT细胞中E-cadherin和β-catenin在表达量均明显减少,胞浆胞膜呈散在分布。结论:TGF-β在体外诱导ras基因转染的小鼠肝细胞发生上皮细胞-间质细胞转化。

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中文摘要  5-7
英文摘要  7-9
前言  9-11
材料与方法  11-37
  一、材料  11-14
  二、主要设备  14-15
  三、化学合成含有 v-ha-ras 基因的质粒、扩增纯化抽提、鉴定  15-18
  四、携带 RAS 基因的慢病毒载体构建  18-26
  五、MMH-D3 小鼠肝细胞培养  26-28
  六、构建表达 v-ha-ras 基因的 MMH-R 细胞  28-34
  七、MMH-R 细胞 EMT 转化为 MMH-RT 细胞  34
  八、细胞爬片免疫荧光对照染色分析  34-37
结果  37-42
讨论  42-45
参考文献  45-47
综述  47-56
  参考文献  52-56
致谢  56

TGF-β与Ras基因在肝癌细胞上皮细胞—间质细胞转化中的作用及机制

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