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耐碳青霉烯类革兰阴性杆菌β内酰胺酶研究

作　者: 骆俊
导　师: 朱德妹；王明贵；徐晓刚
学　校: 复旦大学
专　业: 内科学
关键词: 革兰阴性杆菌铜绿假单胞菌不动杆菌属弗劳地柠檬酸杆菌碳青霉烯类耐药 β内酰胺酶碳青霉烯酶金属酶
分类号: R378
类　型: 博士论文
年　份: 2006年
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内容摘要

碳青酶烯类抗生素亚胺培南90年代初开始用于临床。由于其出色的酶稳定性，对几乎所有的肠杆菌科细菌有着强大的抗菌作用，是治疗产超广谱β内酰胺酶（ESBLs）和头孢菌素酶（AmpC）等多重耐药革兰阴性杆菌的重要药物。然而随着该药在临床的使用，1991年日本发现了质粒介导的产IMP-1金属酶的耐药株，以后各种产IMP和VIM类型金属酶的耐药株和由于外排泵和孔蛋白改变导致的耐药株在世界各地被不断发现。细菌对碳青霉烯类抗生素耐药已经成为抗感染治疗的棘手难题。目前已知细菌产碳青霉烯酶是导致细菌对碳青霉烯类抗生素耐药的重要原因。为了解耐碳青霉烯类抗生素革兰阴性杆菌的耐药机制，我们收集了2003年6月至2004年9月复旦大学华山医院检验医学中心常规纸片法药敏试验结果对碳青霉烯类抗生素（亚胺培南或美罗培南）耐药的菌株，包括铜绿假单胞菌79株、其它假单胞菌13株、不动杆菌7株和弗劳地柠檬酸杆菌8株共107株，研究了这些耐碳青霉烯类菌株的耐药性、同源性、产碳青霉烯酶的基因型、耐药基因的基因定位和产其他β内酰胺酶特征。第一部分耐碳青霉烯类革兰阴性杆菌产碳青霉烯酶的检测、分布和分型采用琼脂对倍稀释法测定包括亚胺培南和美罗培南在内的14种抗菌药物对107株耐碳青霉烯类革兰阴性杆菌的最低抑菌浓度。结果显示107株细菌中有75株铜绿假单胞菌、10株其它假单胞菌、6株不动杆菌和8株弗劳地柠檬酸杆菌共99株细菌亚胺培南对其MIC≥8μg／ml。其中75株耐亚胺培南铜绿假单胞菌和10株耐亚胺培南其它假单胞菌中分别有13株和3株对美罗培南敏感，但耐亚胺培南不动杆菌和弗劳地柠檬酸杆菌对美罗培南亦全部耐药。应用改良Hodge试验和乙二胺四乙酸（EDTA）协同试验法对上述耐碳青霉烯类革兰阴性杆菌进行碳青霉烯酶筛选，同时用bla_VIM-1、bla_VIM-2、bla_IMP-1、bla_IMP-2、bla_SPM、bla_OXA-236组碳青霉烯酶引物进行PCR扩增，并对其中的PCR扩增阳性产物用双脱氧链末端终止法进行DNA测序分析。结果显示4株亚胺培南敏感和75株耐亚胺培南的铜绿假单胞菌Hodge试验均阴性或可疑阳性；EDTA协同试验在75株耐亚胺培南的铜绿假单胞菌中检出2株产金属碳青霉烯酶；经PCR扩增及双脱氧链末端终止法DNA测序分析为VIM—2型金属β内酰胺酶。10株耐亚胺培南的假单胞菌属细菌中2株Hodge试验阳性；EDTA协同试验检出为产金属碳青霉烯酶，均为恶臭假单胞菌；经PCR扩增及双脱氧链末端终止法DNA测序分析亦为VIM—2型金属碳青霉烯酶。6株对亚胺培南耐药的不动杆菌Hodge试验均阳性，但EDTA协同试验示阴性，PCR扩增及双脱氧链末端终止法DNA测序分析，6株均为OXA—23型酶，属丝氨酸碳青霉烯酶。全部8株耐碳青霉烯类弗劳地柠檬酸杆菌均检测到IMP金属酶新亚型，其Hodge试验均阳性，EDTA协同试验呈阳性，PCR扩增及双脱氧链末端终止法DNA测序分析显示为IMP金属酶新亚型。上述结果表明耐碳青霉烯类革兰阴性杆菌中存在产金属碳青霉烯酶（IMP／VIM）或丝氨酸碳青霉烯酶（OXA—23）的克隆株。上述18株产不同型别碳青霉烯酶的革兰阴性杆菌除1株琼氏不动杆菌对多粘菌素B显示耐药外，其他菌株对该药均显示敏感。这些菌株对其他受试的抗菌药物包括第三、四代头孢菌素、β-内酰胺酶抑制剂复方制剂、氨基糖苷类和氟喹诺酮类以及碳青霉烯类均显示耐药（6株不动杆菌对头孢哌酮／舒巴坦复方制剂敏感）。产碳青霉烯酶是导致细菌对碳青霉烯类抗生素耐药的重要原因之一。其中产OXA—23型碳青霉烯酶是导致不动杆菌对碳青霉烯抗生素耐药的主要原因。产IMP新亚型金属酶是导致弗劳地柠檬酸杆菌对碳青霉烯抗生素耐药的主要原因。但对铜绿假单胞菌而言，产碳青霉烯酶可能不是导致其碳青霉烯类耐药的主要原因。75株碳青霉烯耐药铜绿假单胞菌中，仅2株检出VIM—2型金属β内酰胺酶。第二部分耐碳青霉烯类不动杆菌的β内酰胺酶研究对上述经EDTA协同试验显示阴性，改良Hodge试验显示阳性、PCR反应及DNA序列分析为产OXA—23型酶的6株不动杆菌（3株琼氏不动杆菌、3株鲍曼不动杆菌）进一步进行等电聚焦电泳（IEF）测定产β内酰胺酶等电点，bla_TEM，bla_SHV，bla_{CTX-M-Ga～Gc}，bla_OXA-23，bla_MBL等引物的聚合酶链反应进行β-内酰胺酶基因的检测和基因分型，并对PCR产物进行克隆测序；质粒的接合转移试验和Southern Blot进行OXA—23的基因定位；脉冲场电泳（PFGE）研究耐碳青霉烯类不动杆菌的同源性。结果显示6株产OXA—23型碳青酶烯酶耐药不动杆菌中，有5株细菌同时产PER—1型超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）。等电点测定pI5.3为PER—1型超广谱β-内酰胺酶，pI6.65为OXA—23型碳青酶烯酶；质粒接合转移试验未获成功；Southern Blot试验结果显示6株细菌的bla_OXA-23均定位于染色体。脉冲场电泳结果显示3株琼氏不动杆菌属于同一PFGE分型，3株鲍曼不动杆菌分别属于2种PFGE分型。结合6株不动杆菌感染患者的临床资料，提示存在耐药克隆的传播。14种抗菌药物敏感性试验结果显示5株不动杆菌对多粘菌素B敏感，MIC为0.5mg／L—2mg／L；多粘菌素B对不动杆菌A7的MIC为8mg／L。此外6株耐碳青霉烯类不动杆菌对亚胺培南等其他13种抗菌药物均耐药，显示产OXA—23型碳青酶烯酶是导致不动杆菌对碳青霉烯类在内的β-内酰胺类抗生素耐药的重要原因。酶抑制剂舒巴坦可使头孢哌酮单药MIC＞128mg／L下降到联合后的4／2～16／8mg／L。第三部分耐碳青霉烯类弗劳地柠檬酸杆菌产β内酰胺酶的研究对上述经改良Hodge test和EDTA协同试验结果阳性、PCR反应及DNA序列分析为产IMP型金属碳青霉烯酶新亚型的8株弗劳地柠檬酸杆菌，进一步采用等电聚焦电泳（IEF）测定其产β-内酰胺酶的等电点，bla_TEM，bla_SHV，bla_{CTX-M-G1～G3}，bla_AmpC，bla_MBL等引物的聚合酶链反应进行β-内酰胺酶基因的检测和基因分型，并对PCR产物进行克隆测序；质粒的接合转移试验和Southern Blot进行IMP新亚型酶基因的基因定位；脉冲场电泳（PFGE）研究耐碳青霉烯类弗劳地柠檬酸杆菌的同源性。结果发现8株耐碳青霉烯类弗劳地柠檬酸杆菌均产TEM—1型β内酰胺酶，CTX—M—14型ESBLs及IMP型金属酶新亚型，其中4株同时产CTX—M—3型ESBLs。未发现质粒介导的头孢菌素酶。等电点测定pI5.25为TEM-1酶、pI8.1为CTX-M-14型超广谱β-内酰胺酶，pI8.6为CTX-M-3型超广谱β-内酰胺酶，IMP新亚型碳青酶烯酶的pI在8.1-8.6之间；质粒接合转移试验及转化试验未获成功；所有菌株的PFGE谱型均属同一谱型。结合临床资料，8株细菌均分离自华山医院神经外科病房的患者尿液，提示该病区内可能存在耐药克隆的传播。对包括亚胺培南和美罗培南在内的14种抗菌药物的敏感性试验结果8株耐碳青霉烯类弗劳地柠檬酸杆菌除对多粘菌素B（MIC为0.5mg／L-1mg／L）敏感外，对其他亚胺培南和美罗培南等13种抗菌药物均耐药，且耐药程度较高。除环丙沙星的MIC为32mg／L～64mg／L外，其他抗菌药物的MIC大多均≥128mg／L，耐药谱相似。显示产IMP新亚型金属酶是导致弗劳地柠檬酸杆菌对包括碳青霉烯类在内的所有受试β-内酰胺类耐药的重要原因；细菌同时产多种β-内酰胺酶，包括CTX—M型ESBLs等可能亦是导致该类细菌耐药程度高的综合因素。第四部分 IMP新亚型金属酶基因的定位、克隆和表达应用质粒的接合转移试验及转化试验研究上述8株耐碳青霉烯类弗劳地柠檬酸杆菌对碳青霉烯类耐药性的传播特征；采用随机引物标记法制备IMP新亚型基因探针，Southern blot对上述8株耐碳青霉烯类弗劳地柠檬酸杆菌进行IMP新亚型基因定位；通过将IMP新亚型基因在体外与载体PUC18连接转化至大肠埃希菌DH5α，测定11种抗菌药物对重组质粒转化子的MIC，进行IMP新亚型基因的克隆、表达及DNA测序分析；同时结合PCR扩增检测1、2、3类整合子研究IMP新亚型基因的传播机制。结果发现，接合转移试验未获含IMP新亚型的转移接合子；电转化试验同样未获含IMP新亚型的转化子，但获得含CTX-M-14型的转化子；提示IMP新亚型基因可能位于染色体。Southern blot试验证实该IMP新亚型基因位于染色体上。DNA测序结果示该IMP新亚型基因与IMP-8和IMP-20各差1个碱基，与IMP-19差2个碱基。含体外重组PUC18_IMP新亚型质粒的大肠埃希菌转化子EDTA协同试验结果阳性，显示产金属碳青霉烯酶；测定包括碳青霉烯类药物亚胺培南、美罗培南，头孢噻肟、头孢他啶、头孢哌酮、头孢吡肟等第三、第四代头孢菌素，氨曲南，以及阿米卡星、环丙沙星等11种抗菌药物对36株转化子的MIC，结果发现头孢哌酮、头孢噻肟、头孢他啶对转化子的MIC较对受体细胞大肠埃希菌DH5α增加3个对倍稀释度或以上；亚胺培南、美罗培南、头孢吡肟的MIC增加1～2个对倍稀释度，而哌拉西林、氨曲南、阿米卡星、环丙沙星的MIC未见增加。对8株耐碳青霉烯类弗劳地柠檬酸杆菌检测1、2、3类整合子的结果显示：8株耐碳青霉烯类弗劳地柠檬酸杆菌均含1类整合子，不含2、3类整合子；进一步将1类整合酶的引物INT1F与IMP新亚型引物IMP-2n-R进行PCR扩增，结果阳性；该扩增产物DNA测序结果示该DNA序列中含IMP新亚型基因及59be结构，说明IMP新亚型基因位于1类整合子，其位置紧邻1类整合酶及AttI位点旁，与1类整合子关系密切，临床菌株对亚胺培南和美罗培南等碳青霉烯类高度耐药可能与之有关。IMP新亚型基因下游为AAC6基因。综上所述，细菌产碳青霉烯酶是细菌对碳青霉烯类抗生素耐药的重要原因之一。尤其是耐碳青霉烯不动杆菌和耐碳青霉烯类弗劳地柠檬酸杆菌。华山医院的耐碳青霉烯类革兰阴性杆菌中，铜绿假单胞菌和恶臭假单胞菌主要产VIM-2金属碳青霉烯酶，弗劳地柠檬酸杆菌主要产IMP新亚型金属碳青霉烯酶，不动杆菌属细菌主要产OXA-23型丝氨酸碳青霉烯酶。在华山医院的某些病房存在上述产VIM-2、IMP新亚型和OXA-23型碳青霉烯酶革兰阴性杆菌克隆株；这些细菌不但对亚胺培南、美罗培南、头孢噻肟、头孢他啶、头孢哌酮、头孢吡肟等第三、四代头孢菌素及β-内酰胺酶抑制剂复方制剂等β-内酰胺类抗生素耐药，并且对氨基糖苷类和氟喹诺酮类耐药，临床治疗困难。除产碳青霉烯酶外，上述菌株还可产生PER-1、CTX-M-3和CTX-M-14型等多种ESBLs，可能亦是导致该类细菌耐药程度高的原因之一。编码碳青霉烯酶的基因IMP新亚型和OXA-23基因位于染色体。含体外重组PUC18_IMP新亚型质粒的大肠埃希菌转化子可表达产IMP新亚型金属碳青霉烯酶及对抗菌药物的耐药性，但亚胺培南和美罗培南的MIC较临床株为低。IMP新亚型基因位于1类整合子，紧邻1类整合酶及AttI位点，推测与临床菌株对碳青霉烯类高度耐药有关。

全文目录

一.论文摘要  4-13
  中文摘要  4-9
  英文摘要  9-13
二.论文  13-82
  缩略语  13-14
  前言  14-17
  第一部分耐碳青霉烯革兰阴性杆菌碳青霉烯酶的检测、分布及分型  17-28
    材料与方法  17-19
    结果  19-26
    讨论  26-28
  第二部分耐碳青霉烯不动杆菌产β内酰胺酶研究  28-39
    材料与方法  28-32
    结果  32-37
    讨论  37-39
  第三部分耐碳青霉烯弗劳地柠檬酸杆菌产β内酰胺酶研究  39-55
    材料与方法  39-42
    结果  42-54
    讨论  54-55
  第四部分 IMP新亚型的定位、克隆和表达  55-77
    材料与方法  55-66
    结果  66-75
    讨论  75-77
  小结  77-79
  参考文献(论文部分)  79-82
三.综述  82-97
  铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗生素耐药机制的研究进展  82-92
  参考文献(综述部分)  92-97
四.附录  97-100
  试剂、仪器产地一览表  97-98
  抗菌药物对肠杆菌科细菌及非发酵菌的最低抑菌浓度判断标准  98-99
  氨基酸表  99-100
在学期间发表论文  100-101
致谢  101-102
附图  102-103

耐碳青霉烯类革兰阴性杆菌β内酰胺酶研究

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