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表皮生长因子受体配体寡肽与力达霉素组成的基因工程强化融合蛋白的构建及其抗肿瘤活性的研究

作　者: 陈红霞
导　师: 甄永苏
学　校: 中国协和医科大学
专　业: 微生物与生化药学
关键词: 融合蛋白 表皮生长因子受体 博士学位论文 发色团 医科大学 肿瘤细胞 活性研究 辅基 重组表达载体 琼脂糖凝胶电泳
分类号: R73-36
类　型: 博士论文
年　份: 2005年
下　载: 95次
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内容摘要


已知目前在导向药物研究中，单抗偶联毒素的大分子量成为其应用于实体瘤治疗的主要障碍。与表皮生长因子受体特异性结合的配体寡肽GE7具有与表达EGFR的肿瘤细胞特异结合的特性，因此能以其为基础构建肿瘤靶向药物。本研究分别构建了EGFR配体寡肽与力达霉素构成的抗肿瘤基因工程强化融合蛋白SG-LDP-AE和力达霉素辅基蛋白rLDP，并分别对它们的活性进行了研究。此外，为了得到更小分子量的活性力达霉素，进一步对力达霉素辅基蛋白进行截短的尝试，构建了不同的截短的力达霉素辅基蛋白的重组融合表达质粒。 一、EGFR配体寡肽与力达霉素构成的抗肿瘤基因工程融合蛋白SG-LDP的构建及其抗肿瘤活性的研究 表皮生长因子受体EGFR过表达是多种上皮来源人体肿瘤的重要特性，且与患者不良预后有密切关系，因此，EGFR可以作为肿瘤导向治疗的理想靶点。大分子肽类抗生素力达霉素（lidamycin，LDM，又称C-1027）具有细胞毒作用强，体内抗肿瘤活性高的特点，是导向药物的理想“弹头”。力达霉素由辅基蛋白（LDP）和活性烯二炔发色团（AE）组成。LDP和AE可拆分和重建，因此可通过基因工程方法将EGFR特异性结合配体寡肽SG和辅基蛋白重组起来，然后加入发色团进行分子重建产生靶向药物。 本研究首先通过PCR扩增得到EGFR特异性结合的16肽GE7与力达霉素辅基蛋白融合的基因，将其克隆入质粒pET-30a（+）中，构建重组表达载体pET30GLDP。经酶切鉴定和序列测定后，又通过PCR扩增在上述基因前引入信号肽pelB基因序列，同时引入特异性酶切位点NcoI，然后将其克隆入质粒pET-30a（+）中，构建重组表达载体pET30SGLDP。经酶切鉴定和序列测定后，将载体pET30SGLDP转化入大肠杆菌BL21（DE3）starTM中，加入0.05mM IPTG进行诱导表达。通过SDS-PAGE和Western-blot分析外源蛋白的表达，表达产物主要以分泌表达的可溶形式存在于大肠杆菌发酵培养液上清中，表达含量占培养液上清的70％以上。利用羧基端的组氨酸六聚体尾以Ni-NTA His.Bind树脂进行目的蛋白的分离纯化，经透析后每升发酵液可得到约40mg活性蛋白，纯度达95％

全文目录


中文摘要  6-9
英文摘要  9-14
缩略语  14-16
第一部分 EGFR配体寡肽与力达霉素构成的抗肿瘤基因工程融合蛋白SG-LDP及其抗肿瘤活性的研究  16-57
  前言  16-19
  1 实验材料  19-20
    1.1 菌株  19
    1.2 质粒  19
    1.3 细胞株  19
    1.4 动物  19
    1.5 试剂  19-20
    1.6 主要仪器  20
    1.7 培养基  20
  2 实验方法  20-34
    2.1 基本分子生物学实验方法  20-24
    2.2 sgldp基因的克隆和表达载体的构建  24-25
    2.3 sgldp基因在E.coli中的诱导表达  25-30
    2.4 表达产物的纯化和定量  30-31
    2.5 融合蛋白SG-LDP对肿瘤细胞的免疫活性分析  31-33
    2.6 强化融合蛋白SG-LDP-AE的制备  33
    2.7 强化融合蛋白SG-LDP-AE的体内外活性分析  33-34
  3 实验结果  34-53
    3.1 表达载体PET30SGLDP的构建  34-35
    3.2 融合蛋白SG-LDP在大肠杆菌中的表达和检测  35-37
    3.3 表达产物的纯化  37
    3.4 表达产物的生物活性分析  37-38
    3.5 强化融合蛋白SG-LDP-AE的制备  38
    3.6 强化融合蛋白SG-LDP-AE的生物活性分析  38-53
  4 讨论  53-55
  参考文献  55-57
第二部分 完整力达霉素辅基蛋白的构建及活性研究  57-75
  前言  57-58
  1 实验材料  58
  2 实验方法  58-59
    2.1 sldp4基因的克隆和表达载体PET30SLDP4的构建  58-59
    2.2 fldp4基因的克隆和表达载体PET30FLDP4的构建  59
    2.3 其它方法  59
  3 实验结果  59-71
    3.1 表达载体PET30SLDP4的构建  59-60
    3.2 表达载体PET30FLDP4的构建  60-61
    3.3 rLDP蛋白在大肠杆菌中的表达和检测  61
    3.4 表达产物rLDP蛋白的纯化  61-62
    3.5 目的蛋白FLDP4在大肠杆菌中的表达和检测  62
    3.6 融合蛋白rLDP的生物活性分析  62-71
  4 讨论  71-73
  参考文献  73-75
第三部分 截短的不同长度的力达霉素辅基蛋白的重组融合表达载体的构建  75-95
  前言  75-76
  1 实验材料  76
  2 实验方法  76-78
    2.1 sldp1基因的克隆和表达载体PET30SLDP1的构建  76
    2.2 fldp1基因的克隆和表达载体PET30FLDP1的构建  76-77
    2.3 fldp2基因的克隆和表达载体PET30FLDP2的构建  77-78
    2.4 fldp3基因的克隆和表达载体PET30FLDP3的构建  78
  3 实验结果  78-92
    3.1 表达载体PET30SLDP1的构建  78-79
    3.2 表达载体PET30FLDP1的构建  79
    3.3 表达载体PET30FLDP2的构建  79-80
    3.4 表达载体PET30FLDP3的构建  80-81
    3.5 目的蛋白在大肠杆菌中的表达和检测  81-92
  4 讨论  92-94
  参考文献  94-95
论文结论  95-96
文献综述 以EGFR为靶点的抗肿瘤治疗  96-112
  参考文献  107-112
致谢  112-113
附录  113-121

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 肿瘤学实验研究 > 治疗实验
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