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中国葡萄属野生种抗白粉病基因克隆与序列分析

作　者: 王西平
导　师: 王跃进
学　校: 西北农林科技大学
专　业: 果树学
关键词: 葡萄 中国葡萄属野生种 抗白粉病基因 mRNA 差异显示 RACE 芪合成酶基因 抗坏血酸过氧化物酶基因 乙醛脱氢酶基因 抗病基因同源类似物
分类号: S663.1
类　型: 博士论文
年　份: 2004年
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内容摘要


我国的野生葡萄不仅抗病,而且和欧洲葡萄杂交亲和性好,可以有效地将抗病基因与欧洲葡萄品质性状相结合,因而将中国野生葡萄抗病基因与欧洲葡萄品质基因有效结合,培育抗病优良葡萄新品种和创造新型葡萄种质是育种理论和生产实践中急需解决的实际问题。本研究在葡萄白粉病发病盛期,对中国葡萄属野生种华东葡萄株系白河-35-1用病叶压片法人工接种葡萄白粉病病原菌,诱导抗病性表达。利用mRNA 差异显示技术结合cDNA 末端快速扩增技术(RACE)获得了中国葡萄属野生种抗白粉病相关基因全长序列,并进行序列分析;采用抗病基因同源序列方法,进行了中国葡萄属野生种抗病基因同源类似物克隆与分析的研究,取得的主要研究结果如下。1.用T11GG、T11AG、T11AC、T11CC、T11CG 等5 个锚定引物与Operon 公司生产的S421～S429 及B0301～B0326 共46 个随机引物组成了引物对230 个,对供试华东葡萄白河-35-1进行了反转录PCR扩增,筛选出了适于葡萄DDRT-PCR的引物组合186个。应用mRNA差异显示技术研究中国葡萄属野生种华东葡萄株系白河-35-1 在白粉病病原菌侵染诱导下,抗白粉病基因的表达,获得了抗白粉病基因差异表达的cDNA 片段10个: T11AC/B0314-323 、T11AC/B0319-456 、T11AC/S429-704 、T11GG/S438-245 、T11GG/B0316-309 、T11GG/B0324-292 、T11AC/B0313-307 、T11AC/B0320-723 、T11GG/B0322-379 、T11CG/S438-449 。其中T11AC/B0319-456 、T11AC/B0320-723 、T11AC/S429-704、T11CG/S438-449、T11GG/S438-245、T11GG/B0316-309、T11GG/B0324-292、T11AC/B0313-307、T11GG/B0322-379 等9 个片段为白粉病病原菌诱导后表达量增加,另外1 个片段为白粉病病原菌诱导后表达量降低。回收这10 个cDNA 片段并进行克隆、测序及同源性比较分析。将T11AC/B0319-456、T11AC/B0314-323、T11GG/S438-245 等3个片段在GenBank 中登录,登录号分别为:CD662167、CD662168、CD662169。2.首次采用5’RACE 与3’RACE 克隆了中国葡萄属野生种抗白粉病防卫基因-芪合成酶基因家族成员7 个,对其测序分析得出其大小分别为1288 bp、1343 bp、1411 bp、1468 bp、1492 bp、1506 bp 与1556 bp。将这7 个cDNA 序列进行开放阅读框架分析,它们都有完整的开放阅读框架,编码392 个氨基酸,分别命名为VpSTS1、VpSTS2、VpSTS3、VpSTS4、VpSTS5、VpSTS6、VpSTS7。氨基酸序列同源性分析表明,它们与其它植物13种STS 具有很高的同源性,介于94%-99%之间。其中VpSTS7 与河岸葡萄VrSTS2,

全文目录


中文摘要  5-8
英文摘要  8-16
第一章 文献综述  16-42
  1.1 葡萄白粉病  16-18
    1.1.1 葡萄白粉病的起源及分布  16
    1.1.2 葡萄属植物对白粉病的抗性  16
    1.1.3 葡萄抗白粉病遗传  16-17
    1.1.4 葡萄属植物抗白粉病的分子生物学研究  17-18
  1.2 植物抗病的分子生物学研究  18-35
    1.2.1 植物抗病机制  18-20
    1.2.2 植物抗病基因的类型、结构与功能  20-26
      1.2.2.1 植物抗病基因的类型  20
      1.2.2.2 植物抗病基因的结构与功能  20-26
    1.2.3 植物抗病基因克隆的方法  26-33
      1.2.3.1 图位克隆法  26-27
      1.2.3.2 转座子标签法  27-28
      1.2.3.3 抗病基因同源序列法  28-31
      1.2.3.4 mRNA差异显示  31-33
    1.2.4 植物防卫基因  33-35
      1.2.4.1 已克隆的防卫反应基因  34
      1.2.4.2 防卫反应基因的结构特点  34
      1.2.4.3 防卫反应基因的表达调控  34-35
  1.3 本研究的目的意义  35-36
  参考文献  36-42
第二章 中国葡萄属野生种抗白粉病基因cDNA的克隆与序列分析  42-72
  1 材料与方法  42-51
    1.1 材料  42-44
      1.1.1 葡萄材料  42
      1.1.2 生化试剂  42-43
      1.1.3 仪器  43-44
    1.2 实验方法  44-51
      1.2.1 病原菌孢子萌发实验  44
      1.2.2 葡萄白粉病病原菌田间人工接种  44
      1.2.3 葡萄叶片总RNA提取与纯化  44-46
        1.2.3.1 葡萄总RNA的提取  44-45
        1.2.3.2 总RNA的纯化和检测  45-46
      1.2.4 cDNA第一链的合成  46
      1.2.5 DDRT-PCR  46
      1.2.6 6% 聚丙烯酰胺凝胶电泳  46-47
      1.2.7 银染  47
      1.2.8 中国葡萄属野生种抗白粉病基因差异cDNA片段的克隆与测序  47-51
        1.2.8.1 中国葡萄属野生种抗白粉病基因差异cDNA片段的回收与二次PCR扩增  47
        1.2.8.2 二次PCR扩增产物的回收  47-48
        1.2.8.3 连接反应  48
        1.2.8.4 大肠杆菌感受态细胞的制备  48-49
        1.2.8.5 连接产物的转化  49
        1.2.8.6 重组质粒的筛选与鉴定  49-50
        1.2.8.7 重组质粒的酶切鉴定  50
        1.2.8.8 差异cDNA片段测序及序列分析  50-51
  2 结果与分析  51-66
    2.1 田间人工接种白粉病病原菌后叶片抗白粉病表现  51
    2.2 葡萄总RNA提取  51
    2.3 mRNA差异显示分析  51-54
      2.3.1 适于葡萄DDRT-PCR引物组合的筛选  51-53
      2.3.2 中国野生葡萄抗白粉病基因差异cDNA片段的获得  53-54
    2.4 中国葡萄属野生种抗白粉病差异cDNA片段的克隆与测序  54-55
      2.4.1 中国葡萄属野生种抗白粉病差异cDNA片段的克隆  54-55
      2.4.2 中国葡萄属野生种抗白粉病差异cDNA片段的序列  55
    2.5 中国葡萄属野生种抗白粉病差异cDNA片段的序列分析  55-66
      2.5.1 抗白粉病特有差异cDNA片段的同源性分析  55-57
      2.5.2 差异cDNA 片段T_11AC/B0319-456 同源性分析  57-59
      2.5.3 差异cDNA T_11AC/B0320-723同源性分析  59-60
      2.5.4 差异cDNA T_11GG/B0324-292同源性分析  60-61
      2.5.5 差异cDNA片段T_11CG/S438-449同源性分析  61-63
      2.5.6 差异cDNA片段T_11AC/S429-704同源性分析  63-65
      2.5.7 差异cDNA片段T_11GG/B0322-379同源性分析  65-66
  3 讨论  66-68
    3.1 葡萄属植物抗白粉病研究  66-67
    3.2 抗白粉病差异cDNA的获得及同源性分析  67-68
  参考文献  68-72
第三章 中国葡萄属野生种抗白粉病芪合成酶基因的克隆及序列分析  72-97
  1 材料与方法  73-77
    1.1 材料  73-74
      1.1.1 葡萄材料  73
      1.1.2 生化试剂  73
      1.1.3 菌株  73-74
    1.2 田间人工接种葡萄白粉病病原菌  74
    1.3 葡萄总RNA的提取  74
    1.4 5'RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends )与3’RACE特异引物设计  74
    1.5 3'RACE  74-76
      1.5.1 3'RACE引物  74
      1.5.2 3'RACE cDNA第一链的合成  74-75
      1.5.3 3'RACE-PCR反应体系及程序  75-76
    1.6 5'RACE  76
      1.6.1 5'RACE引物  76
      1.6.2 5'RACE cDNA第一链的合成  76
      1.6.3 5'RACE PCR反应体系与程序  76
    1.7 RACE产物克隆测序及序列分析  76-77
  2 结果与分析  77-87
    2.1 5'RACE与3'RACE  77-80
    2.2 葡萄芪合成酶基因cDNA全长序列及序列分析  80-87
    2.3 核酸序列分析及推导的氨基酸序列分析  87
  3 讨论  87-94
    3.1 葡萄芪合成酶基因  87-92
    3.2 葡萄属植物白藜芦醇的抗病性  92
    3.3 芪合成酶基因工程  92-94
  参考文献  94-97
第四章 中国葡萄属野生种抗白粉病相关基因的克隆及序列分析  97-100
  1 材料与方法  97-98
    1.1 材料  97
    1.2 田间人工接种白粉病病原菌  97
    1.3 葡萄总RNA的提取  97
    1.4 5'RACE  97
    1.5 5'RACE片段的克隆及测序  97
    1.6 核酸序列分析及推导的氨基酸性质分析  97-98
  2 结果与分析  98-100
    2.1 5'RACE  98
    2.2 抗白粉病相关基因T_11AC/B0313-1708的获得及序列分析  98-100
第五章 中国葡萄属野生种抗白粉病抗坏血酸过氧化物酶基因的克隆及序列分析  100-111
  1 材料与方法  100-101
    1.1 材料  100
      1.1.1 葡萄材料  100
      1.1.2 生化试剂  100
      1.1.3 菌株  100
    1.2 田间人工接种白粉病病原菌  100-101
    1.3 葡萄总RNA的提取  101
    1.4 5'RACE与3'RACE扩增cDNA片段两段序列  101
    1.5 5'RACE与3'RACE cDNA 片段的克隆及测序  101
    1.6 核酸序列分析及推导的氨基酸性质分析  101
  2 结果与分析  101-107
    2.1 5'RACE与3'RACE  101-103
    2.2 抗坏血酸过氧化物酶基因cDNA序列全长的获得及序列分析  103
    2.3 核酸序列及推导的氨基酸序列分析  103-107
  3 讨论  107-109
  参考文献  109-111
第六章 中国葡萄属野生种乙醛脱氢酶基因的克隆及序列分析  111-126
  1 材料和方法  111-113
    1.1 材料  111-112
      1.1.1 葡萄材料  111
      1.1.2 试剂  111-112
    1.2 方法  112-113
      1.2.1 田间人工接种葡萄白粉病病原菌  112
      1.2.2 葡萄总RNA提取及纯化  112
      1.2.3 5'RACE与3'RACE  112-113
      1.2.4 核酸序列分析及推导的氨基酸性质分析  113
      1.2.5 RT-PCR  113
  2 结果与分析  113-122
    2.1 5'RACE与3'RACE  113
    2.2 葡萄乙醛脱氢酶基因cDNA全长的获得  113-115
    2.3 核酸序列及推导的氨基酸序列分析  115-116
    2.4 中国野生葡萄VpALDH的诱导表达分析  116-122
  3 讨论  122-124
  参考文献  124-126
第七章 中国葡萄属野生种抗病基因同源类似物(RGA)的克隆  126-142
  1 材料与方法  126-132
    1.1 材料  126-128
      1.1.1 葡萄材料  126-128
      1.1.2 生化试剂  128
      1.1.3 仪器  128
    1.2 方法  128-132
      1.2.1 葡萄基因组DNA提取  128-129
      1.2.2 引物的设计与合成  129-130
      1.2.3 PCR反应体系  130
      1.2.4 DNA特异片段的回收  130
      1.2.5 连接反应  130
      1.2.6 大肠杆菌感受态细胞的制备  130-131
      1.2.7 重组质粒的筛选与鉴定  131
      1.2.8 重组质粒的酶切鉴定  131-132
      1.2.9 DNA特异片段的测序及序列分析  132
  2 结果与分析  132-135
    2.1 葡萄抗病基因同源类似物(RGA)特异引物对的筛选  132-133
    2.2 葡萄属植物RGA分析  133
    2.3 萄萄属植物RGA的克隆、测序及核苷酸序列分析  133-135
    2.4 葡萄RGA中的氨基酸保守区域  135
  3 讨论  135-140
    3.1 利用抗病基因同源序列克隆抗病基因的可行性  135-139
    3.2 葡萄抗病基因RGA的序列分析  139-140
  参考文献  140-142
第八章 结论  142-144
附录  144-162
致谢  162-163
作者简介  163

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中图分类: > 农业科学 > 园艺 > 果树园艺 > 浆果类 > 葡萄
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