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酿酒酵母乙醇脱氢酶2和乙醛脱氢酶以及两种水生动物抗菌肽的表达和酶活分析

作 者: 舒梅
导 师: 许杨
学 校: 南昌大学
专 业: 食品科学
关键词: 乙醇脱氢酶 乙醛脱氢酶 基因表达 亲和层析 酶动力学 抗菌肽 融合蛋白 包涵体 抑菌活性
分类号: Q78
类 型: 硕士论文
年 份: 2011年
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内容摘要


1乙醇脱氢酶2和乙醛脱氢酶的表达及酶学性质分析酿酒酵母中的乙醇脱氢酶2催化乙醇氧化生成乙醛,乙醛脱氢酶催化乙醛氧化生成乙酸。本研究从酿酒酵母基因组中分别克隆、表达乙醇脱氢酶2和乙醛脱氢酶,对其进行了纯化,然后体外测定酶活及酶动力学分析。为研发新型解酒食品提供理论基础。主要内容如下:1.1从酿酒酵母基因组DNA扩增获得6种酶的基因并构建了6个表达载体,pRX2-ADH2、pRX2-ALDH6、pRX2-ALDH2、pRX2-ALDH3、pRX2-ALDH4和pRX2-ALDH5,分别转化E.coli BL21,通过乳糖自诱导表达目的蛋白,6种酶得到成功表达,但ADH2和ALDH4主要以包涵体形式表达;1.2重新构建3个表达载体,pGEX-ADH2, pBAD-ADH2和pBAD-ALDH4,优化表达条件,初步判断ALDH4以可溶性形式表达,ADH2仍然以包涵体形式表达;1.3采用Ni-NTA His.Bind Resin亲和层析柱纯化带有6His·Tag的重组蛋白,纯化后经SDS-PAGE检测日的蛋白的纯度约为90%;采用Bradford蛋白测定法测得ADH2、ALDH6、ALDH2、ALDH3和ALDH5浓度分别为2.07mg/mL,1.624mg/mL,0.6635 mg/mL,0.7596 mg/mL(?)0.9615 mg/mL;1.4体外测定复性后的ADH2和纯化得到的乙醛脱氢酶活性,通过紫外可见分光光度计测定产物β-NADH和(3-NADPH的生成量,结果显示ADH2、ALDH6、ALDH2、ALDH3和ALDH5的比活力分别约为2.107U/mg,16.86 U/mg,1.416U/mg,1.566U/mg和2.742U/mg;1.5研究温度、pH值和金属离子对ADH2和乙醛脱氢酶活力的影响。得出ADH2、ALDH6、ALDH5、ALDH2和ALDH3最适温度分别为45℃,30℃,37℃,37℃和50℃,最适pH值分别为7.4,7.4,8.0,7.4和8.5。1.6研究ADH2和乙醛脱氢酶酶动力学性质。ADH2对NAD+和乙醇的Km分别为1.1 mM和120μM, ALDH6和ALDH5对NADP+和乙醛的Km分别为(101μM,42μM)和(664μM,129μM), ALDH2和ALDH3对NAD+和氨基丙醛的Km分别为(471μM,17.5μM)和(410μM,8.6μM)。2两种抗菌肽的克隆、表达及活性分析将两种水生动物分泌的抗菌肽丛因克隆到原核表达载体pGEX-4T-1上,构建了pGEX-Y18和pGEX-CEC1两个融合蛋白表达载体,转化至表达宿主菌Escherichia coli Rosetta中进行表达,表达的融合蛋白主要以包涵体形式存在。融合蛋白经复性、酶切处理获得抗菌Y18和CECl。抑菌实验结果表明,融合蛋白GST-Y18和GST-CEC1、抗菌肽Y18和CECl都能有效地抑制E.coli DH5α、Bacillus subtilis、Staphyloccocus aureus Rosenbach和Saccharomyces cerevisiae的生长。为后续的将抗菌肽基因序列串连单体的形式高量表达实验奠定了良好的基础。

全文目录


摘要  3-5
ABSTRACT  5-7
缩略语表  7-9
目录  9-12
第1章 前言  12-24
  1.1 酒精体内代谢过程  12-13
  1.2 酿酒酵母乙醇脱氢酶乙醛脱氢酶的研究进展  13-21
    1.2.1 乙醇脱氢酶  13-16
    1.2.2 乙醛脱氢酶  16-21
  1.3 乙醇脱氢酶、乙醛脱氢酶的分离纯化  21-22
    1.3.1 ADH的分离纯化  21
    1.3.2 ALDH的分离纯化  21-22
  1.4 乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶的应用  22
    1.4.1 乙醇脱氢酶的应用  22
    1.4.2 乙醛脱氢酶的应用  22
  1.5 主要研究内容和意义  22-24
    1.5.1 主要研究内容  22-23
    1.5.2 研究意义  23-24
第2章 乙醇脱氢酶2和乙醛脱氢酶克隆与表达  24-45
  2.1 材料、仪器与试剂  24-26
    2.1.1 材料  24
    2.1.2 主要仪器  24-25
    2.1.3 培养基和溶液  25-26
    2.1.4 生化试剂  26
  2.2 方法与步骤  26-32
    2.2.1 引物设计  26-27
    2.2.2 酵母基因组的提取  27
    2.2.3 乙醇脱氢酶2和乙醛脱氢酶基因PCR扩增与鉴定  27-28
    2.2.4 表达载体pRX2质粒的提取(试剂盒提取)  28
    2.2.5 质粒pRX2和目的片段的双酶切  28-29
    2.2.6 原核表达载体pRX2与目的片段连接  29
    2.2.7 大肠杆菌DH5α电转感受态细胞的制备  29-30
    2.2.8 连接产物的转化  30
    2.2.9 阳性克隆子的筛选与鉴定  30-31
    2.2.10 重组质粒转化至表达宿主菌  31
    2.2.11 重组蛋白的高密度自诱导表达  31-32
  2.3 结果与分析  32-42
    2.3.1 PCR扩增结果  32-33
    2.3.2 原核表达载体的构建  33-38
    2.3.3 原核表达质粒在大肠杆菌中诱导表达及可溶性分析  38-42
  2.4 讨论与小结  42-45
    2.4.1 讨论  42-43
    2.4.2 小结  43-45
第3章 乙醇脱氢酶2复性与酶学性质分析和乙醛脱氢酶纯化与酶学性质分析  45-66
  3.1 仪器与试剂  45-46
    3.1.1 主要仪器  45
    3.1.2 主要试剂  45-46
  3.2 方法  46-51
    3.2.1 ADH2复性  47
    3.2.2 FPLC纯化蛋白条件的研究  47-48
    3.2.3 日的蛋白的纯化  48
    3.2.4 Bradford法测定蛋白浓度  48-49
    3.2.5 目的蛋白酶活测定  49-50
    3.2.6 目的蛋白酶学性质分析  50-51
  3.3 结果  51-63
    3.3.1 ADH2复性  51
    3.3.2 FPLC纯化蛋白优化条件的分析  51-54
    3.3.3 目的蛋白纯化  54-55
    3.3.4 目的蛋白浓度的测定  55-56
    3.3.5 目的蛋白酶活力测定  56-57
    3.3.6 目的蛋白酶学性质分析  57-63
  3.4 讨论与小结  63-66
    3.4.1 讨论  63-65
    3.4.2 小结  65-66
第4章 两种水生动物抗菌肽的原核表达及活性分析  66-81
  4.1 材料和试剂  67-68
    4.1.1 材料  67-68
    4.1.2 主要试剂  68
    4.1.3 缓冲液体系  68
  4.2 方法  68-74
    4.2.1 引物  68
    4.2.2 抗菌肽CEC1和Y18可能结构的预测  68-69
    4.2.3 pGEX-Y18和pGEX-CEC1表达载体的构建  69-73
    4.2.4 Y18和CEC1融合蛋白的诱导表达  73
    4.2.5 Y18和CECI融合蛋白的复性与酶切  73-74
    4.2.6 体外抗菌肤活性测定  74
  4.3 结果  74-79
    4.3.1 抗菌肽CEC1和Y18的可能结构及作用模式  74
    4.3.2 融合蛋白表达载体的构建和鉴定  74-76
    4.3.3 两种融合蛋白的诱导表达  76-77
    4.3.4 可溶性融合蛋白的纯化与凝血酶酶切  77
    4.3.5 包涵体的复性与凝血酶酶切  77-78
    4.3.6 两种抗菌肽抗菌活性的检测  78-79
  4.4 讨论与小结  79-81
第5章 结论与展望  81-82
  5.1 结论  81
  5.2 展望  81-82
参考文献  82-89
致谢  89-90
攻读学位期间的研究成果  90
个人简历  90

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程(遗传工程)
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