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鹿茸多肽对骨髓间质干细胞软骨分化生物学行为的影响

作　者: 修忠标
导　师: 林建华
学　校: 福建中医学院
专　业: 中医骨伤科学
关键词: 骨性关节炎/中药疗法 骨髓间质干细胞/药物作用 鹿茸多肽/药物作用 分化/药物作用 调亡/药物作用
分类号: R285.5
类　型: 博士论文
年　份: 2005年
下　载: 273次
引　用: 2次
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内容摘要


目的:在细胞和分子水平观察鹿茸多肽对骨髓间质干细胞（MSCs）体外分化软骨细胞生物学行为的影响,以优化软骨组织工程的种子细胞,改善软骨的修复质量,并对鹿茸多肽的作用机制进行初步探讨。方法:1.抽取兔骨髓液经密度梯度离心得到的单个核细胞,经体外分离、培养获得兔MSCs。2.采用相差显微镜观察其生长情况,透射电镜观察细胞结构,流式细胞仪检测细胞表面抗原,MTT比色法描绘生长曲线。3.将获得的兔MSCs分成不同药物浓度组并进行药物干预,48h后采用MTT比色、免疫细胞化学、流式细胞仪分析细胞周期等方法,观察鹿茸多肽对MSCs增殖的影响。4.将第3代兔MSCs分为空白对照组、诱导组及鹿茸多肽组,采用原培养液、诱导培养液及含10ug/ml鹿茸多肽的诱导培养液于离心管内进行培养,分别于1、2、3w后取材,通过组织学、生物化学和RT-PCR技术,对离心管内构建的软骨组织进行形态学和细胞功能状态的研究。5.将软骨表型化兔MSCs分为空白对照组、诱导组及鹿茸多肽组,用IL-1β诱导细胞凋亡,并用鹿茸多肽干预。分别于24h、48h、72h后取样。采用透射电镜观察细胞形态,Annexin V法检测细胞凋亡率,RT-PCR分析CasPase-3mRNA表达水平,ELISA检测CasPase-3蛋白酶活性。结果1.原代兔MSCs成均匀分布的簇状生长、形态梭形。在传代培养中形态特性无明显变化、均质性提高。细胞功能活跃,体积大,有大量扩张粗面内质网、高尔基复合体及线粒体。CD34、CD45表达阴性,CD29、CD90表达阳性,证实这些细胞是非造血干细胞。细胞1-3d增殖缓慢,3-5d快速增殖,5-7d趋于平缓,7-9d呈下降趋势。2.10ug/ml鹿茸多肽获得最佳促进MSCs增值效应,且能逆转MSCs在体外连续培养过程中异倍体的产生;在软骨诱导培养条件下其能促进GAG分泌及Ⅱ型胶原mRNA的表达;鹿茸多肽能减少CasPase-3mRNA表达,抑制其蛋白酶活性,降低细胞凋亡率。结论:1.通过体外对MSCs的分离培养与鉴定,可以建立较完善的MSCs培养体系。2.鹿茸多肽在促进MSCs增殖的同时可以减少其异行性的产生,并对MSCs定向软骨分化有明显促进作用。3.CasPase-3参与细胞凋亡,鹿茸多肽通过抑制

全文目录


目录  2-5
中文摘要  5-7
英文摘要  7-9
引言  9-11
第一部分 骨髓间质干细胞的分离培养与鉴定  11-17
  前言  11
  1．1 材料  11
  1．2 方法  11-13
    1．2．1 MSCs的分离培养及倒置相差显微镜观察  11-12
    1．2．2 MSCs透射电镜观察  12
    1．2．3 MSCs表面标记检测  12
    1．2．4 描绘生长曲线  12-13
    1．2．5 统计学方法  13
  1．3 结果  13-14
    1．3．1 MSCs形态学观察结果  13
    1．3．2 MSCs表面标记检测结果  13
    1．3．3 MSCs生长曲线分析结果  13-14
  1．4 讨论  14-16
  1．5 小结  16-17
第二部分 鹿茸多肽对兔骨髓间质干细胞体外增殖的影响  17-23
  前言  17
  2．1 材料  17-18
  2．2 方法  18-19
    2．2．1 MTT比色试验  18
    2．2．2 流式细胞仪检测细胞周期  18
    2．2．3 PCNA表达  18-19
    2．2．4 统计学方法  19
  2．3 结果  19-20
    2．3．1 MTT比色试验结果  19-20
    2．3．2 流式细胞仪检测结果  20
    2．3．3 PCNA表达结果  20
  2．4 讨论  20-22
  2．5 小结  22-23
第三部分 鹿茸多肽对MSCs体外软骨表型诱导分化的影响  23-30
  前言  23
  3．1 材料  23-24
  3．2 方法  24-26
    3．2．1 MSCs的软骨诱导培养  24
    3．2．2 H．E染色显微镜观察  24
    3．2．3 阿力新蓝染色检测 GAG合成  24
    3．2．4 二甲基亚甲蓝显色法测定 GAG含量  24-25
    3．2．5 RT-PCR检测Ⅱ型胶原mRNA表达  25-26
    3．2．6 统计学方法  26
  3．3 结果  26-27
    3．3．1 离心管聚集体培养的细胞团块形态学观察结果  26
    3．3．2 硫酸GAG含量测定结果  26-27
    3．3．3 Ⅱ型胶原mRNA表达检测结果  27
  3．4 讨论  27-29
  3．5 小结  29-30
第四部分 鹿茸多肽对软骨表型化MSCs凋亡的影响  30-38
  前言  30
  4．1 材料  30-31
  4．2 方法  31-33
    4．2．1 软骨表型化MSCs分组诱导培养  31
    4．2．2 透射电镜观察  31
    4．2．3 流式细胞仪检测细胞凋亡率  31
    4．2．4 RT-PCR检测caspase-3 mRNA表达  31-33
    4．2．5 ELISA分析caspase-3蛋白酶活性  33
    4．2．6 统计学方法  33
  4．3 结果  33-35
    4．3．1 透射电镜观察结果  33
    4．3．2 细胞凋亡率检测结果  33-34
    4．3．3 caspase-3 mRNA表达检测结果  34
    4．3．4 caspase-3蛋白酶活性测定结果  34-35
  4．4 讨论  35-37
  4．5 小结  37-38
结论  38-39
参考文献  39-43
致谢  43-44
附录  44-69
  附录1 附图  44-50
  附录2 综述 骨髓间质干细胞软骨分化生物学的影响因素  50-56
  附录3 在校期间发表论文目录  56-57
  附录4 在校期间发表论文(第一作者)  57-69
  附录5 个人简历  69

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中图分类: > 医药、卫生 > 中国医学 > 中药学 > 中药药理学 > 中药实验药理
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