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人TIMP-1基因克隆、体外肾脏细胞基因转导、转基因小鼠建立及其肾脏表型变化

作　者: 林洪丽
导　师: 陈香美
学　校: 军医进修学院
专　业: 肾脏病学
关键词: 基因转导表型变化肾脏细胞外基质基因克隆转基因动物技术系膜细胞重组真核表达载体高效表达 ECM降解无血清
分类号: R692.02
类　型: 博士论文
年　份: 2001年
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内容摘要

肾脏细胞外基质(Extracellular metrix，ECM）合成和降解及肾脏固有细胞增殖、分化和凋亡在肾脏的正常发育和肾脏疾病的发生和发展中有着重要的作用。金属蛋白酶组织抑制剂-l（tissue inhibitormetalloproteinase-1，TIMP-l）是基质金属蛋白酶抑制剂家族的主要成份，可以通过抑制基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）的活性而阻断其对 ECM的降解作用，引起 ECM的积聚，在脏器纤维化过程中有重要的作用。此外，晚近的研究表明：TIMP-1除了上述抑制细胞外基质降解的功能外，还参与某些细胞的增殖、分化和凋亡，因止TIMP-1被认为是一个多功能因子，本研究旨在通过基因转导技术进一步探讨TIMP-1抑制肾脏ECM降解的作用，以及除此之外，TIMP-1在肾脏是否存在新的功能。根据Genebank中TIMP-1基因的碱基序列，用RT-PCR的方法从人的正常肾组织中克隆出了包含信号肽密码在内的TIMP-1全长cDNA序列。采用T-A克隆的方法将之插入pCRR2.1中间载体，DNA测序证实该片段序列与文献报告的完全一致。利用亚克隆的方法将 TIMP-l cDNA片段克隆到 pCDNA3载体上，构建出正义及反义TIMP-1重组真核表达载体pCDNA3/TIMP-1和pCDNA3／ATIMP-1，通过脂质体 DOTAP将 pCDNA3／TIMP-l转染至 COS-7细胞，Northern及原位杂交证实在 COS-7细胞上获得人 TIMP-1的高效表达，细胞增殖实验表明TIMP-1的高效表达可促进COS-7细胞的增殖。构建表达正义及反义 TIMP-1的逆转录病毒载体，经 PA317细胞包装后获得病毒上清，测定滴度后以之感染大鼠肾卜球系膜细胞，Northern杂交证实了正、反义TI肝＜在大鼠系膜细胞上可以高效表达，在基因水平上实现了 TIMP－1的高表达或低表达。实验结果表明：转染正义的TIMP－1基因后，系膜细胞的ECM成分FN和IV型胶原的蛋白质水平的表达明显增高，与之相反，转染反义的TIMP－1基因后，系膜细胞的ECM成分刚和w型胶原的蛋白质水平的表达明显减低，但上述系膜细胞FN和IV型胶原的mRNA水平均没有变化，说明TIMP－1在系膜细胞上的过表达抑制了FN和IV型胶原的降解，转染及义 TIMP－1基因引起大鼠内源性 TIMP－1下调，导致了刚和二型胶原的降解增加。反义HMP一工基因这种促进大鼠系膜细胞脱M降解的作用，即从分子水平反证了TIMPl抑制肾脏ECM降解的作用，同时也为利用逆转录病毒载体介导反义TIMPJ在体内进行某些肾脏疾病治疗研究提供一定的实验基础。将正义及反义TIMP－1 的重组真核表达载体PCDNA3－TIMP－1 和pCDNA3咕＜转染至大鼠的肾＊、球系膜细胞中，Northern 杂交及We s t ern杂交证实了x、反义TIMP人在大鼠系膜细胞Lv以高效表达。t血清诱导大鼠系膜细胞凋亡，利用TUNEL染色、DNA片段分析技术在无血清后的不同时间点检测细胞凋亡，结果表明转染反义TIMP－1基因的大鼠系膜细胞于无血清1卜小时即开始发生凋亡；无外源基因转染及空载体转染的大鼠系膜ic胞在无血清 48，J、时发生凋亡；而转染正义 TIMP－1基因的大鼠系膜细胞在无血清4天时才开始发生凋亡。Northern杂交结果表明 TIMP－1可抑制大鼠系膜细胞 bax的表达，但并不影响比 1《的表达。这一结果提示了HMP司在肾脏除了抑制ECM降解作用外还具有抑制体外培养的大鼠系膜细胞的凋亡的新功能。TIMP－1对大鼠系膜细胞凋亡的作用可能部分是通过对bax表达的抑制作用来完成的。为了进一步在整体水平上探讨原发的TIMP－1高表达对肾脏的影响。我 — —R．86MX68——＆qd＃①——们通过显微注射的方法建立了TIMP－1转基因，J、鼠，Southern杂交和PCR产物测序证实了外源的人TIMP－1基因稳定整合到。J、鼠的染色体上并遗传给后代。免疫组化结果证实了外源的人 TIMP－1在肾脏获得表达。该小鼠的成功制备及目的基因在肾脏获得表达为进一步在整体水平研究 TI MP刁在肾脏中的作用提供了良好的模型。我｛fi观察到＊＊P八。J、鼠肾脏的发育较正常，J、鼠更为成熟，肾，J、球数目及肾小球平均面积增加，肾小球成熟指数升高。肾脏增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）的表达较正常＊。鼠为低。进一步检测在肾脏发育中有关键作用的血管内皮生长因子（vascularendothelial growth factor，VEGF）和它的酪氨酸激酶受体Fib 一1的表达，结果表明 VEGF及其受体 FIk叫表达的上调。我们的初步研究结果表明，TIMP－1在肾脏的局部高表达可以上调VEGF和Fib－1在肾脏的表达，TIMP－1可能参与肾脏的发育。总之，我们利用体外基因转导和转基因动物技术，在分子、细胞和动物整体三个层次上探讨了正义及反义TIMPI对’肾脏的细胞外基质、肾1、球系膜细胞凋亡和肾＊、球发育的影响及初步机制，阐述了＊mP八在肾脏新的作用并为之提供了更为直接的证据。

全文目录

  4-7
  7-10
论文一、人TIMP-1 cDNA克隆、真核表达载体构建及在COS-7细胞中的表达  10-23
论文二、TIMP-1基因转染对大鼠肾小球系膜细胞表达FN和IV型胶原的影响  23-36
论文三、TIMP-1基因转染对大鼠肾小球系膜细胞凋亡及相关基因表达的影响  36-48
论文四、人 TIMP-1转基因小鼠的建立及肾脏表型变化  48-63
综述一、 MMPs／TIMPs在肾脏疾病中的研究进展  63-79
综述二、转基因动物技术及其研究进展  79-92
致谢  92-93

人TIMP-1基因克隆、体外肾脏细胞基因转导、转基因小鼠建立及其肾脏表型变化

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