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肺动脉平滑肌细胞的结构变化在缺氧性肺动脉高压发生、发展中的作用及其机制初探

作　者: 宋为
导　师: 邓希贤；蔡英年；龚伊红
学　校: 中国协和医科大学
专　业: 生理学
关键词: 表型转变结构变化肺动脉表型转化合成表表型变化肌性动脉生长因子离体培养部分合成
分类号: R363
类　型: 博士论文
年　份: 1993年
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内容摘要

本工作从整体、组织、细胞、分子水平对PASMC在肺血管结构重建中的变化特点、作用及其发生机制作了较为系统的研究。主要结果如下：一、PASMC的结构变化在HPH发生、发展中的作用 (1) 正常肺腺泡内动脉中非肌性动脉(NMA)构成比最大，因此其对肺血流量和阻力的改变有很大缓冲作用，具有很大的代偿能力；而IAA的另两组份——肌性动脉(MA)和部分肌性动脉(PMA)则是控制PAP的主要血管段。实验结果表明，缺氧1d，IAA即出现肌化(MA增多、NMA减少)，并随缺氧时间延长而加重，导致阻力段血管延长，致使PAP升高，二者呈密切相关。肺血管结构变化的这一特点无疑是HPH发生的结构基础。 (2) 首次在整体动物上观察到，缺氧后还可能存在PASMC表型的动态变化。即整个缺氧进程中(1～40d)，随着缺氧时间的延长，部分PASMC有由收缩表型→部分合成表型→合成表型→部分合成表型→收缩表型转变的可能性。相应肺动脉壁羟脯氨酸(胶原的主要结构氨基酸)含量亦由持续增加过渡到出现下降趋势。提示缺氧状态下，PASMC表型变化不是固定不变，血管结构重建有可逆的可能，为HPH防治显示了较好前景。同时表明PASMC表型变化也可能参与肺高压的适应性调节。二、缺氧时PASMC结构变化的原因 1．PAEC结构和功能变化对PSAMC的影响 ①首次系统观察到慢性缺氧过程中，PAEC由前期缺氧时严重水肿变性，到伴随缺氧时间延长出现代偿适应性增生的动态结构变化。这对PASMC结构变化具有重要意义，表现为，EC胞内水肿致使其抑制SMC及其前体细胞生长的分泌活动受损，为血管肌化原因之一。EC下水肿造成EC与其下基质分离，削弱EC对SMC的生长抑制，为血管肌化的另一因素。EC下水肿损伤基质可释放基质结合型FGFb，加重EC及SMC增殖。后期缺氧时EC的增生、肥厚反映出血管内高压力、高剪切速率对EC的影响，使管腔更加狭窄。结合体外实验缺氧致使培养的PAEC增殖并释放促SMC增生物质，提示缺氧刺激导致EC促分裂因子作用的自分泌和旁分泌活动增强，促使EC、SMC增生及SMC前体细胞转化，为加重血管肌化的主因。

全文目录

中文摘要  5-8
英文缩写词  8-10
1.文献综述  10-35
2.前言  35-36
3.材料与方法  36-50
  3.1.主要试剂及仪器  36-37
  3.2.主要溶液的配制  37-38
  3.3.整体动物实验  38-41
    3.3.1.动物模型  38
    3.3.2.血流动力学指标测定  38
    3.3.3.IAA结构观察  38-39
      3.3.3.1.IAA分类计数  38-39
      3.3.3.2.IAA内膜面积测量及EC核计数  39
      3.3.3.3.IAA超微结构观察  39
    3.3.4.肺外动脉结构与相应功能的观察  39-41
      3.3.4.1.超微结构观察  39-40
      3.3.4.2.离体肺动脉环Ach内皮依赖性舒张反应的测定  40
      3.3.4.3.肺动脉壁羟脯氨酸含量测定  40-41
  3.4.离体细胞培养  41-49
    3.4.1.成年牛、新生小牛PASMC体外培养及生长曲线  41-43
      3.4.1.1.贴块法培养PASMC  41-42
      3.4.1.2.绘制生长曲线  42-43
    3.4.2.培养PASMC缺氧模型的建立及有关指标测定、药物干预实验  43-45
      3.4.2.1.相对生长静息PASMC的获取  43
      3.4.2.2.缺氧模型  43
      3.4.2.3.~3H-TdR参入法检测PASMC DNA合成  43
      3.4.2.4.DNA含量测定  43-44
      3.4.2.5.影响PASMC ~3H-TdR参入的药物干预实验  44-45
    3.4.3.培养PASMC透射电镜标本制备  45
    3.4.4.新生小牛、成年牛PAEC培养、缺氧实验、缺氧EC条件培养液(HECCM)对培养PASMC ~3H-TdR参入的影响  45
      3.4.4.1.PAEC体外培养  45
      3.4.4.2.缺氧实验  45
      3.4.4.3.HECCM的收集及对培养PASMC ~3H-TdR参入的影响  45
    3.4.5.利用核酸分子原位杂交技术检测培养PASHC内原癌基因mRNA表达  45-47
      3.4.5.1.平滑肌(SM)α-actin及非肌性(NM)β-actin基因质粒转化、扩增  45-46
      3.4.5.2.光敏生物素直接标记SM α-actin和NM β-actin目的基因质粒DNA  46-47
      3.4.5.3.培养PASMC原位杂交  47
    3.4.6.培养PASMC总RNA的c-myc斑点及Northern膜印迹杂交  47-49
      3.4.6.1.细胞总RNA的提取  47
      3.4.6.2.c-myc斑点杂交  47-48
      3.4.6.3.Northern膜印迹杂交  48
      3.4.6.4.用随机寡核苷酸引物合成均一标记的c-myo cDNA探针  48
      3.4.6.5.分子杂交及放射自显影  48-49
  3.5.数据处理  49-50
4.结果  50-73
  4.1.IAA肌化与肺循环血流动力学变化趋势的关系  50-52
  4.2.肺动脉中膜SMC表型及肺动脉壁羟脯氨酸含量变化与PAP的关系  52-53
  4.3.肺动脉EC结构及Ach内皮依赖性舒张反应的动态变化  53-56
  4.4.缺氧时培养PAEC的变化及PAEC对SMC增殖的影响  56-59
  4.5.缺氧对培养PASMC的直接影响  59-72
    4.5.1.缺氧对PASMC增殖的影响  59-63
    4.5.2.缺氧对PASMC表型的影响  63-65
    4.5.3.缺氧对施用了细胞信息传导途径干预药物后PASMC ~3H-TdR参入的影响  65-67
      4.5.3.1.异搏定、H_7  65
      4.5.3.2.PMA、EGF  65-67
      4.5.3.3.EGF+PMA、异搏定+PMA复合作用  67
    4.5.4.缺氧对PASMC c-myc mRNA表达的影响  67-72
  4.6.764-3对PASMC ~3H-TdR参入的影响  72-73
附：1.电镜照片插图  73-84
  2.照片说明  82-84
5.讨论  84-89
  5.1.PASMC的结构变化在缺氧性肺动脉高压发生、发展中的作用  84-85
  5.2.缺氧时PASMC结构变化的原因  85-89
    5.2.1.PAEC结构和功能的变化对PASMC的影响  85-86
    5.2.2.缺氧对SMC结构变化的直接影响及其作用途径初探  86-89
6.总结  89-90
7.参考文献  90-98
8.英文摘要  98-102
已发表和待发表的研究论文及论文摘要  102-105
致谢  105

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