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美洲黑杨材性侯选基因的克隆和功能分析

作　者: 王大海
导　师: 苏晓华
学　校: 中国林业科学研究院
专　业: 林木遗传育种
关键词: 微纤丝角木材密度 RNAi 美洲黑杨 cDNA表达芯片 RACE VLG-Walking
分类号: S792.11
类　型: 博士论文
年　份: 2008年
下　载: 238次
引　用: 2次
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内容摘要

近年来,木材形成的分子机制研究已成为植物分子生物学研究热点之一,而针对木材性状控制分子基础的研究很少。基因芯片分析技术具有高通量、高灵敏度和高可信度等特点,是植物功能基因组学研究的有力工具之一。本研究从美洲黑杨(Populus deltoides)主干不同高度存在木材性状差异入手,通过构建杨树未成熟木质部cDNA文库,制作cDNA表达芯片,用于研究主干不同高度处基因表达差异,筛选出树木材性相关候选基因;克隆部分候选基因的全长序列,包括基因组上全长序列,分析其在杨树基因组上的分布情况;在此基础上,构建适合杨树基因功能研究的pRNAi载体和部分候选基因的RNAi、反义表达载体,对杨树组培苗进行遗传转化、转基因鉴定和候选基因表达分析,主要研究结果如下:(1)成年美洲黑杨母树主干不同高度木材密度和微纤丝角(microfibril angle)大小分布存在差异,木材密度(wood density)随高度呈下降趋势,而微纤丝角呈先下降后上升趋势;杨树主干由下而上,木材微纤丝角大小与密度之间相关性不大。(2)利用SMART技术构建了美洲黑杨及美洲黑杨×青杨(Populus deltoides×Populus cathayana) F2子代未成熟木质部全长cDNA文库。从美洲黑杨和美洲黑杨×青杨F2子代未成熟木质部文库中分别随机挑取10000和5000个单克隆用于芯片探针制备,获得11181个单一cDNA探针,制作cDNA表达芯片,用于杨树主干不同高度处基因表达分析。筛选出差异表达点274个,并进行序列测定;得到125条单一序列,与已知功能同源的序列62条,占49.6%;其中,抵抗环境胁迫相关的基因占11%,参与基因功能调控4%,参与合成细胞结构组份有关的基因和转录因子各占6%,与信号传导有关的基因占8%,代谢和次生代谢有关的基因占8%;余下63条序列中,有60条序列在杨树ESTs数据库找到同源序列,有3条序列在EST数据库无同源序列,为美洲黑杨特异表达的序列;(3)芯片实验发现,组成细胞组分的核糖体rRNA在美洲黑杨主干高密度部位(基部)表达量高;而组成染色体组蛋白H2B1在低密度部位(4 m,6 m)表达量高;丙苯氨酸解氨酶和4-香豆酸-CoA连接酶与木材密度之间的相关系数绝对值分别为0.69和0.95,推测两种酶的表达与木材密度相关;植物Remorin蛋白与维纤丝角分布的相关系数为0.92,表现出很高的相关性;转录因子中,锌指蛋白、细胞延伸因子、CCR4相关因子、DNA/RNA结合蛋白与木材密度的相关性高,其表达可能影响木材密度的形成;乙烯应答元件结合因子的不同基因表达各不相同,乙烯应答元件结合因子4、乙烯应答元件结合因子5和乙烯应答元件结合蛋白与木材密度相关性好,但乙烯应答元件结合蛋白3的表达与木材密度相关性差;控制细胞生长发育或组织器官形成有关的基因中细胞周期有关蛋白,微管组织结构形成有关基因,细胞生长/分化有关基因与木材密度相关性较大,可能与木材密度形成有关。从测序结果分析来看木材密度及微纤丝角大小分布与一些调控有关的基因表达水平间具很高的相关性。这一结果表明,控制木材性状的主要是一些调控基因,而非直接行使功能的基因。(4)采用RACE技术克隆ZF-RNG、CytoB和EXO全长cDNA;利用拟基因组文库染色体步行法(VGL-Walking)从杨树基因组上获得ZF-RNG全长序列和CytoB 5’端序列。经Spidey软件分析,ZF-RNG基因包含有9个内含子和10个外显子; Blast软件分析表明,ZF-RNG基因位于杨树基因组LG_VI 16611332-16616623物理位置,并在基因组LG_XVIII上具部分同源序列; CytoB基因在染色体上为双拷贝,分别位于杨树基因组数据簇LG_IX物理位置的8914871- 8915817和LG_I物理位置的17937655-17938359。(5)对目标基因在未成熟木质部、叶片组织、花芽和叶芽中的表达状况分析, ZF-RNG基因在花芽中表达量最高,未成熟木质部组织次之,叶片组织和叶芽中表达量相差无几,结果表明该基因与发育相关;EXO基因在叶片中表达量最高,其它部位间表达量相差无几;CytoB基因在花芽和叶芽组织中表达量最高,在叶片组织中表达量低,而未成熟木质部组织中表达量一般。(6)克隆了ZF-RNG基因内含子Intron 9片断,利用pUC19克隆载体和pBI121植物表达载体,构建pRNAi载体;利用pRNAi载体、pBI121 Hind III、EcoRI酶切载体片段和CytoB扩增的CDS片段,构建成CytoB基因反义表达载体pAntiCytoB和RNAi表达载体pRNAi-CytoB2EX;采用农杆菌介导法,对中国山杨(Populus davidiana)组培苗25#进行遗传转化,获得再生植株;经PCR验证,获得34个CytoB RNAi转化子和7个CytoB反义转化子;随机对其中2个CytoB RNAi转化子和2个CytoB反义转化子进行RT-PCR检测,其中标号为A24的CytoB RNAi转化子的表达量降低到1/5以下,而其它三个转化子基因表达不发生变化。

全文目录

摘要  5-7
Abstract  7-13
第一章绪论  13-36
  1.1 引言  13-15
    1.1.1 研究背景  13-14
    1.1.2 研究目的和意义  14-15
    1.1.3 项目来源与经费支持  15
  1.2 国内外研究现状及评述  15-33
    1.2.1 木材的形成、材性控制机理及研究进展  15-23
    1.2.2 现代分子遗传学研究技术  23-33
    1.2.3 研究评述  33
  1.3 研究目标和主要研究内容  33-35
    1.3.1 研究目标  33-34
    1.3.2 主要研究内容  34-35
  1.4 研究技术路线  35-36
第二章研究材料与方法  36-73
  2.1 美洲黑杨不同部位材性测定  36
    2.1.1 实验材料  36
    2.1.2 实验方法  36
  2.2 杨树未成熟木质部cDNA 文库构建及芯片制作  36-46
    2.2.1 实验材料  37
    2.2.2 实验方法  37-46
  2.3 芯片杂交分析  46-50
    2.3.1 实验材料  46-47
    2.3.2 实验方法  47-50
  2.4 目标基因克隆及表达分析  50-59
    2.4.1 实验材料  51
    2.4.2 实验方法  51-59
  2.5 通用型RNAi 载体构建  59-64
    2.5.1 实验材料  59
    2.5.2 实验方法  59-64
  2.6 CytoB 基因RNAi 及反义表达载体构建和遗传转化  64-73
    2.6.1 实验材料  64
    2.6.2 实验方法  64-73
第三章结果与分析  73-112
  3.1 美洲黑杨不同部位材性测定  73-74
    3.1.1 实验结果  73
    3.1.2 分析  73-74
    3.1.3 小结  74
  3.2 未成熟木质部cDNA 文库构建  74-79
    3.2.1 实验结果  74-77
    3.2.2 分析  77-79
    3.2.3 小结  79
  3.3 芯片杂交结果分析和讨论  79-89
    3.3.1 RNA 质量检测  79-80
    3.3.2 芯片杂交  80
    3.3.3 差异表达点序列测定和生物信息学分析  80-82
    3.3.4 讨论  82-88
    3.3.5 小结  88-89
  3.4 目标基因克隆及表达研究  89-104
    3.4.1 结果  89-97
    3.4.2 分析  97-102
    3.4.3 小结  102-104
  3.5 通用型RNAi 载体构建结果与分析  104-105
    3.5.1 结果与分析  104-105
    3.5.2 小结  105
  3.6 目标候选基因RNAi 及反义表达载体构建和遗传转化  105-112
    3.6.1 结果  105-109
    3.6.2 分析  109-110
    3.6.3 小结  110-112
第四章结论与讨论  112-117
  4.1 结论  112-115
  4.2 讨论  115-116
  4.3 展望  116-117
参考文献  117-127
附录  127-133
在读期间的学术研究  133-134
致谢  134

美洲黑杨材性侯选基因的克隆和功能分析

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