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降香对丹参的吸收动力学影响及其机制研究

作　者: 梅超
导　师: 孙晓波
学　校: 长春中医药大学
专　业: 中药学
关键词: 中药复方君-使药对配伍促吸收 P-糖蛋白摄取 Caco-2细胞 MDCK细胞
分类号: R285
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

中药复方配伍是中医药领域研究的难点问题,是中医辨证论治精髓的具体表现形式。中药复方由两味或两味以上的单味药组成,在中医理论指导下,选择合适的药物酌定药量,按照“辩证施治”的原则组方,它集中体现了中医理论治法治则、配伍理论和组方原则,是中医防治疾病的主要形式[1,2]。而药对是中药复方中最简单、最基本的药物组方形式,符合复方中“辩证施治”、“七情和合”,体现了复方的有效性和合理性,可通过研究药对配伍来揭示复方配伍的科学性和合理性,君-使药对是中药复方中的特殊对药,能体现中医药的配伍关系且组分比较简单,易于研究。因此,研究君使药对之间的相互作用及其机制,对揭示中药复方配伍规律,继承和发展中医药有重要意义。本文从简单的药对研究出发,选择了冠心丹参滴丸方中作为佐使药的降香,其含有的挥发油和黄酮-柚皮素对君药丹参中的隐丹参酮和丹酚酸B的吸收动力学影响及其促吸收机制展开研究,主要内容如下:第一部分:隐丹参酮在生物样品中测定方法的建立为本课题体内、外相关的研究,建立了简便、灵敏、可靠、无干扰的检测隐丹参酮(Cryptotanshinone,CTS)在Caco-2细胞(the hunman colon carcinoma cellline,人结肠癌细胞)中的UPLC方法、在大鼠血浆中LC-MS/MS方法,以及在丹参浸膏药液中的HPLC方法。实验结果显示,Caco-2细胞样品中:CTS与内标分离较好,线性范围为5～640ng/mL,最低定量限为5 ng/mL,标准曲线相关系数r>0.99,批内批间变异系数小于13%,方法回收率大于90%,质控样品、冻融稳定性均符合要求。大鼠血浆样品中:CTS与内标分离较好,线性范围为2.5～2400ng/mL,最低定量限为2.5ng/mL,标准曲线相关系数r>0.99,提取回收率大于70%,质控样品、冻融稳定性、基质效应均符合要求。所建立的测定方法均符合生物样品的测定要求,并具有简便、灵敏、稳定、无干扰的优点。第二部分:使药降香对君药丹参中的隐丹参酮和丹酚酸B的吸收动力学影响在整体试验上,对降香挥发油、黄酮促进CTS和SalB在大鼠体内的吸收进行了较为系统的研究。运用HPLC法对丹参浸膏中的CTS和SalB的含量进行了测定,以及用气相和气-质联用技术对降香挥发油中的含量和成分进行了检测,考察了大鼠灌服丹参浸膏和浸膏-挥发油后,CTS和SalB药代动力学过程的差异。实验结果显示:测得浸膏中CTS为1.175±0.472mg/g,SalB为26.089±4.718mg/g,用气相和气-质色谱对降香中的挥发油进行了含量和成分的测定,共鉴定出5种物质,其中橙花叔醇含量最高,经面积归一化法计算,标准品中的含量约占总挥发油的56.30% ,饱和挥发油Hanks’液中,检测出的橙花叔醇的含量约占46.53%,饱和挥发油培养基中,橙花叔醇含量49.84%。通过单药组和合药组数据统计对比显示,加入降香挥发油和柚皮素后t1/2α、t1/2β、AUC、Cmax、V1/F、CL/F有显著性差异,降香挥发油和柚皮素的存在,使CTS和SalB在体内吸收入血量增加,在体内消除减慢并向组织中分布增加,从而印证了使药降香的增效-导向作用,为降香的促吸收机制提供了依据。第三部分:降香挥发油和降香黄酮-柚皮素对隐丹参酮和丹酚酸B分别在Caco-2和MDCK细胞中的摄取影响本部分的研究目的是建立了Caco-2和MDCK细胞的药物摄取体外模型,在此模型基础上对CTS和SalB的摄取特性,及降香挥发油、柚皮素对CTS和SalB摄取特性影响进行了较系统的研究,并以细胞形态学的观察、Rh123双向转运实验进行模型验证,并在此模型上,加入CsA(50μM)考察对CTS和SalB摄取的影响。实验结果显示,Caco-2单层细胞膜具有完整性、致密性,P-gp转运体存在着明显的蛋白表达并具有良好的功能活性,揭示Caco-2细胞保持了小肠上皮细胞的特性,适用于药物摄取实验研究。CTS和SalB在Caco-2和MDCK细胞中的摄取量随时间延长而增加,37℃的CTS和SalB的摄取量明显高于4℃时的摄取量。CTS和SalB与降香挥发油分别合用后,在Caco-2细胞中CTS摄取达峰时间提前,由60min提前到45min,吸收速率加快,坪值增加,吸收程度提高,40min时摄取量增加了85.6%,60min增加了36.6%;在MDCK细胞中,由于降香挥发油的存在,CTS摄取量40min增加了61.8%,60min增加了48.7%。在CsA存在下,CTS和SalB的摄取量有增加趋势,CTS增加21%,SalB增加了16.94%,提示P-gp可能参与了CTS和SalB的摄取,CTS和SalB可能为P-gp的底物。Western Blot显示挥发油对P-gp表达基本无影响,降香黄酮具有下调P-gp表达的作用。以上结果表明,CTS和SalB的摄取具有时间、温度、浓度依赖性,CTS和SalB在小肠中的吸收机制以主动转运为为主,有被动扩散的参与;降香挥发油能非特异性的促进CTS和SalB在小肠的吸收;降香中的柚皮素能特异性的作用于P-gp,从而促进CTS和SalB在小肠的吸收。

全文目录

中文摘要  8-11
Abstract  11-14
前言  14-15
英文缩略语  15-16
文献综述  16-23
  1 化学成分  16-18
  2 药理作用及机制  18-20
  3 体内过程  20-21
  4 配伍研究  21-22
  5 展望  22-23
第一部分隐丹参酮在生物样品中测定方法的建立  23-34
  一材料与方法  23-27
    1.UPLC 法测定 Caco-2 内隐丹参酮浓度的方法建立  23-24
      1.1 试剂与仪器  23
      1.2 分析条件  23
      1.3 细胞样品的处理  23
      1.4 方法学考察  23-24
    2. LC-MS/MS 法测定大鼠血浆中 CTS 浓度的方法建立  24-27
      2.1 试剂与仪器  24-25
      2.2 分析条件  25
      2.3 实验动物  25
      2.4 血浆样品的制备  25
      2.5 方法学考察  25-27
  二结果  27-31
    1. UPLC 法测定 Caco-2 内 CTS 浓度的方法学考证  27-29
      1.1 标准曲线的制备和最低检测限  27
      1.2 方法的专属性  27
      1.3 方法的回收率  27-28
      1.4 方法的精密度  28
      1.5 冻融稳定性  28
      1.6 检测方法的质控  28-29
    2. LC-MS/MS 法测定大鼠血浆中 CTS 浓度的方法学考证  29-31
      2.1 标准曲线与最低检测限  29
      2.2 方法的专属性  29-30
      2.3 提取回收率  30
      2.4 方法的精密度  30
      2.5 冻融稳定性  30-31
      2.6 基质效应  31
      2.7 检测方法的质控  31
  三讨论  31-34
    1. 检测方法的选择  31-32
    2. Caco-2 细胞中检测条件的选择  32
    3. 血浆样品中检测条件的选择  32
    4. 小结  32-34
第二部分降香挥发油和降香黄酮-柚皮素对丹参中的隐丹参酮和丹酚酸 B 的吸收动力学影响研究  34-50
  一材料与方法  34-39
    1. 丹参浸膏中 CTS 和 SalB 含量的测定  34-35
      1.1 试剂与仪器  34
      1.2 供试品溶液的制备  34-35
      1.3 方法学考察  35
    2. 降香挥发油含量和成分的检测  35-36
      2.1 仪器与试药  35-36
      2.2 供试品溶液的制备  36
      2.3 挥发油饱和Hanks’样品的制备  36
      2.4 挥发油饱和培养基的制备  36
      2.5 气相色谱试验  36
      2.6 气质试验  36
    3. 降香挥发油对隐丹参酮和丹酚酸B 的吸收动力学影响  36-38
      3.1 试剂与仪器  36-37
      3.2 实验动物  37
      3.3 供试品溶液的制备  37-38
    4. 柚皮素对隐丹参酮和丹酚酸B 的吸收动力学影响  38-39
      4.1 试剂与仪器  38
      4.2 实验动物  38
      4.3 供试品溶液的制备  38
      4.4 动物实验设计  38
      4.5 血浆样品的制备  38-39
      4.6 色谱条件  39
  二.结果  39-48
    1. 丹参浸膏中 CTS 和 SalB 标准曲线和最低检测限  39
    2. 丹参浸膏中 CTS 和 SalB 方法的专属性  39-40
    3. 丹参浸膏中丹酚酸B 和隐丹参酮的含量  40-41
    4. 气相色谱试验  41-42
    5. 气-质联用试验  42-44
    6. 含药血浆测定结果  44
    7. 降香挥发油对 CTS 和 SalB 的吸收动力学影响研究结果  44-46
    8. 柚皮素对 CTS 和 SalB 的吸收动力学影响研究结果  46-48
  三. 讨论  48-50
    1. 丹参浸膏中 CTS 和 SalB 含量测定实验条件的选择  48
    2. 气相色谱和气-质联用测定降香挥发油的成分与含量  48-49
    3. 单用药与合用药的对比研究  49
    4. 小结  49-50
第三部分降香挥发油和黄酮对丹酚酸 B 和隐丹参酮分别在 Caco-2 和 MDCK 细胞中的摄取影响研究  50-68
  一材料与方法  50-57
    1. 试剂、仪器与药液配制  50-52
    2. Caco-2 和MDCK 细胞的培养和单层模型的建立  52
    3. 蛋白印迹检测P-gp 的表达  52-53
    4. P-gp 功能活性分析  53
    5. 考马斯亮蓝G-250 显色法测定蛋白含量  53-54
    6. 降香挥发油、丹酚酸B、隐丹参酮和柚皮素的细胞毒性试验  54
    7. CTS 和 SalB 分别在 Caco-2 和 MDCK 细胞中的摄取特性  54-55
    8. 降香挥发油对 CTS、SalB 在 Caco-2 和 MDCK 细胞中的摄取影响  55-56
    9. 柚皮素对 SalB、CTS 在 Caco-2 和 MDCK 细胞中摄取影响  56-57
  二结果  57-65
    1. CaCo-2 和 MDCK 细胞模型的建立  57
    2. P-gp 蛋白表达测定  57-58
    3. P-gp 功能活性分析  58
    4. 考马斯亮蓝G-250 显色法测定蛋白含量  58-59
    5. MTT 试验结果  59
    6. CTS 和 SalB 在 CaCo-2 和 MDCK 细胞中的摄取试验  59-62
    7. 蛋白印迹P-gp 的表达  62-63
    8. 降香挥发油对 CTS 和 SalB 在 Caco-2 和 MDCK 细胞中的摄取影响  63-64
    9. 降香挥发油和柚皮素对 CTS 和 SalB 在 Caco-2 细胞中的摄取影响对比  64-65
  三讨论  65-68
    1. 细胞模型的建立  66
    2. Caco-2 细胞中P-gp 的表达  66
    3. CTS 和SalB 分别在Caco-2 和MDCK 模型中的摄取特性  66
    4. 降香挥发油和柚皮素在细胞模型上对CTS 和SalB 摄取的影响  66-67
    5. 小结  67-68
结语  68-69
致谢  69-70
参考文献  70-74

降香对丹参的吸收动力学影响及其机制研究

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