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皂苷C抑制血管紧张素Ⅱ促血管平滑肌细胞增殖作用及其机制研究

作　者: 洪丹
导　师: 张国刚
学　校: 中南大学
专　业: 内科学
关键词: 皂苷C 增殖 NADPH氧化酶活性氧 ERK1/2 转录因子
分类号: R285
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

研究背景：高血压病及其并发症是心血管疾病的主要死亡原因之一,血管重塑在其中扮演了关键角色。血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell, VSMC)增殖是血管重塑发生发展的主要病理生理过程之一研究证实血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ, AngⅡ)诱导的VSMC增殖在高血压血管重构过程中起着重要作用,可通过升高还原型辅酶Ⅱ(nicotinamide-adenine dinucleotide phosphate, NADPH)氧化酶活性,促进活性氧(reactive oxygen species, ROS)产生,然后通过ROS／丝裂原活化蛋白激酶(mitoten-activated protein kinase, MAPK)通路介导VSMC增殖。细胞外信号调节激酶1/2 (extracellular signal-regulated kinases 1/2, ERK1/2)是最经典的MAPK通路,生长因子、细胞因子刺激VSMC增殖的效应主要是由ERK1／2介导,ERK1／2磷酸化激活后,进一步诱导下游靶点如核转录因子-κB (nuclear factor-KB, NF-κB)、活化蛋白-1 (activator protein-1, AP-1)、c-myc活化,从而促进VSMC增殖。皂苷C (reinioside C, RC)是从传统中药黄花倒水莲(Polygala fallax Hemsl)中提取的主要活性成分之一。现代药理研究发现,黄花倒水莲具有抗应激、抗病毒、调血脂、活血、抗炎、抗衰老和抗脂质过氧化等作用。近期研究发现皂苷C能够抑制氧化低密度脂蛋白诱导的单核-内皮细胞粘附,其机制可能与其抑制氧化应激有关。本课题拟在培养的VSMC,观察皂苷C对AngⅡ诱导的VSMC增殖的作用,并探讨其可能机制。方法：(1)不同浓度的皂苷C (3、10、30μM)、ROS特异性抑制剂DPI (10μM)预处理VSMC 1 h后,再加入10-6MAngⅡ处理VSMC 24 h, BrdU标记法分析细胞DNA合成能力,流式细胞仪检测细胞周期评估细胞增殖水平。(2)不同浓度的皂苷C (3、10、30μM)、DPI (10μM)预处理VSMC 1 h后,再加入10-6M AngⅡ处理VSMC 24 h, Real-time PCR检测细胞内NADPH氧化酶亚基：p22phox、gp91phoxmRNA的表达,DCFH-DA荧光法检测细胞内ROS水平。(3)不同浓度的皂苷C(3、10、30μM)、DPI(10μM)、ERK1/2特异性抑制剂PD98059(40μM)预处理VSMC 1 h后,再加入10-6M AngⅡ处理VSMC 2 h, Western Blot法检测磷酸化ERK1／2的表达。(4)不同浓度的皂苷C (3、10、30μM)、NF-κB特异性抑制剂PDTC (10μM)、PD98059 (40μM)预处理VSMC 1 h后,再加入10-6M AngⅡ处理VSMC 24 h,收集浆蛋白后,采用Western blot法检测IκB-α蛋白表达；收集核蛋白后,采用凝胶迁移实验测定NF-κB活性。(5)不同浓度的皂苷C (3、10、30μM)、DPI (10μM)、PD98059 (40μM)预处理VSMC 1 h后,再加入10-6M AngⅡ处理VSMC 24 h, Real-time PCR测定AP-1亚基：c-fos和c-jun;原癌基因：c-mycmRNA的表达。结果：(1)AngⅡ(10-6M)处理24 h显著刺激VSMC增殖,皂苷C(3, 10,30μM)可浓度依赖性地抑制AngⅡ诱导的促增殖效应,ROS特异性抑制剂DPI (10μM)可明显抑制Angll所致的上述作用,单独应用皂苷C (30μM)对VSMC增殖无影响。(2)AngⅡ(10-6M)处理2h显著增加VSMC中NADPH氧化酶亚基：p22phox、gp91phoxmRNA表达和ROS生成,皂苷C (3,10, 30μM)可浓度依赖性地抑制AngⅡ诱导的p22phox、gp91phoxmRNA表达和ROS生成,DPI (10μM)可明显抑制Angll上述作用,单独应用皂苷C (30μM)对NADPH氧化酶和ROS生成无影响。(3)AngⅡ(10-6M)处理2h显著促进ERK1／2磷酸化,皂苷C(3, 10,30μM)可浓度依赖性地抑制Angll诱导的ERK1／2磷酸化,DPI (10μM)和ERK1／2特异性抑制剂PD98059 (40μM)可明显抑制AngⅡ诱导的ERK1／2磷酸化,单独应用皂苷C(30μM)对ERK1／2磷酸化无影响。(4) AngⅡ(10-6M)处理24 h显著增强VSMC中NF-κB活性,上调c-fos、c-jun、c-myc mRNA的表达,皂苷C (3,10,30μM)可浓度依赖性地降低AngⅡ诱导的NF-κB活性,抑制AP-1和c-myc表达,NF-κB特异性抑制剂PDTC (10μM)和ERK1／2特异性抑制剂PD98059 (40μM)可显著抑制AngⅡ所致的上述作用,单独应用皂苷C(30μM)对NF-κB/AP-1通路无影响。结论：皂苷C可抑制Ang II诱导的血管平滑肌细胞增殖作用,该作用部分通过抑制NADPH氧化酶-ROS-ERK1/2-NF-κB/AP-1通路实现。

全文目录

中文摘要  4-8
ABSTRACT  8-13
英文缩略语表  13-14
第一章前言  14-16
第二章材料与方法  16-23
  1.1 试剂和仪器  16-17
  1.2 血管平滑肌细胞培养  17
  1.3 实验设计和分组  17-19
  1.4 BrdU标记法分析细胞DNA合成能力  19
  1.5 流式细胞仪检测细胞周期  19
  1.6 DCFH-DA荧光法检测ROS  19-20
  1.7 Real-time PCR 法测定NADPH 氧化酶亚基:p22~(phox) and gp91~(phox);AP-1亚基-c-fos and c-jun;原癌基因:c-myc mRNA的表达  20
  1.8 Western blot法检测ERK1/2磷酸化及IκB-α蛋白降解  20-21
  1.9 凝胶迁移或电泳迁移率实验测定NF-κB活性  21-22
  1.10 统计学方法  22-23
第三章结果  23-30
  2.1 皂苷C对AngⅡ诱导血管平滑肌细胞增殖的影响  23
  2.2 皂苷C对AngⅡ诱导的NADPH氧化酶和ROS的影响  23
  2.3 皂苷C对AngⅡ诱导的ERK1/2磷酸化的影响  23
  2.4 皂苷C对AngⅡ诱导的NF-κB/AP-1通路的影响  23-24
  附图  24-30
第四章讨论  30-33
第五章结论  33-34
参考文献  34-38
综述血管平滑肌细胞增殖与心血管疾病  38-47
  参考文献  43-47
致谢  47

皂苷C抑制血管紧张素Ⅱ促血管平滑肌细胞增殖作用及其机制研究

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