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乙烯诱导伏令夏橙果实脱落过程中重要功能基因的克隆、表达与功能分析

作　者: 杨雪莲
导　师: 钟广炎
学　校: 西南大学
专　业: 果树学
关键词: 柑橘基因组芯片 RNAi 低氧应答基因伤害诱导基因乙烯受体(ETR2)
分类号: S666.4
类　型: 博士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

柑橘果实发育过程中若受到过度胁迫会导致大量落果,从而造成大幅度减产,特别是晚熟品种在越冬时常会遇到低温,导致采前落果,造成巨大损失。另外,目前柑橘的采收方式主要为人工采摘,成本很高,在美国甚至超过柑橘生产成本的总和。因此,能实现果实的可控脱落成为柑橘生产者和科研工作者追求的主要目标之一。本研究利用柑橘基因组芯片(Citrus Genome Array)研究乙烯诱导柑橘果实脱落并探讨其分子机理。研究中使用浓度为20μL/L的乙烯分别处理带叶的伏令夏橙(Citrus sinensis cv. Valencia)果实4 h、12 h和24 h,然后提取果实离层RNA进行芯片检测。聚类分析结果表明,芯片数据具有较好的重复性。12条典型基因的Real Time-PCR分析结果也表明这些基因表达的变化趋势与芯片数据基本一致。对乙烯诱导的差异表达基因进行分析,发现乙烯处理3个时间点上均表达的基因有510条(P<0.01)。对差异表达基因进行功能分析,发现乙烯诱导下上调表达的主要有编码膜类蛋白、能量代谢相关蛋白、胁迫相关蛋白、转录因子、丝氨酸／苏氨酸激酶类、磷酸酶类、钙离子结合蛋白类、水解酶类、乙烯代谢途径相关蛋白、转移酶类、受体蛋白类等基因,下调表达的主要包括编码核糖体类蛋白、水解酶类、水通道蛋白、细胞色素P450、金属离子结合蛋白、光合系统相关蛋白、ABC转运蛋白、脂酶类等基因。进一步分析发现,编码乙烯代谢途径相关蛋白的基因、伤害诱导基因和编码低氧胁迫蛋白的基因之间存在着关联表达,因而筛选出ETR2、低氧应答基因和伤害诱导基因进行深入研究。主要结果如下：克隆了乙烯诱导表达的低氧应答基因(CsHRP)并进行表达分析。采用RACE技术克隆了CsHRP的全长cDNA并测序分析。结果表明,CsHRP的cDNA全长为795 bp, ORF编码98个氨基酸。序列比对分析结果显示CsHRP与甜橙低氧应答基因的同源性达97%。对蛋白质二级结构的预测结果推测CsHRP可能与抗病有关。采用Real-time PCR方法检测了CsHRP在外源乙烯诱导下的表达情况,结果显示CsHRP在乙烯处理前期(4 h)高度表达,12 h后减低到原来的水平。乙烯可诱导伤害诱导蛋白(Wound induced proteins, WIPs)的表达。本研究克隆了柑橘的4条伤害诱导基因CsWIP1、CsWIP2、CsWIP3和CsWIP4,序列分析结果表明这4个伤害诱导基因分为两类,其中CsWIP1、CsWIP2和CsWIP3聚为一类,而CsWIP4与前三者在结构上差异较大故聚为另一类。WIP蛋白在C-端有一个非常保守的α-螺旋,在N-端也有一个α-螺旋,CsWIP1、CsWIP2和CsWIP3在两个α-螺旋处都保守,而CsWIP4只在C-端α-螺旋处保守。Real-time PCR结果显示：CsWIP1仅在外源乙烯处理下表达,受乙烯诱导；CsWIP1无论是在伤害处理还是在乙烯处理条件下,仅在叶片中表达,说明CsWIP2的表达具有组织特异性;CsWIP3在乙烯或伤害处理的叶片和离层中均表达,说明CsWIP3的表达没有组织特异性；CsWIP4仅在伤害处理下表达,基本上不受乙烯调控。ETR2是乙烯受体基因之一。为深入了解乙烯受体基因(ETR2)在伏令夏橙果实脱落过程中的作用,本研究克隆了ETR2基因并研究了其表达。通过RACE技术得到ETR2的cDNA序列为1800 bp。序列比对分析表明伏令夏橙ETR2与其它甜橙ETR2的同源性达98%。ETR2蛋白质包含了3个结构域,分别为GAF结构域、组氨酸蛋白激酶(HPK)同源二聚体结合区域和类似CheY结构域。通过Real-time PCR检测了ETR2在外源乙烯诱导4 h、12 h和24 h时的表达量。结果显示,ETR2在乙烯诱导4 h、12 h和24 h的表达量分别是对照的2倍、4倍和1倍。为进一步验证CsHRP和CsWIP1在柑橘果实脱落中的作用,本研究以转基因技术分别培育了CsHRP和CsWIP1的过量表达和RNAi转基因柑橘苗。目前已获得转基因抗性芽,现正在对转基因植株进行鉴定。

全文目录

摘要  7-9
ABSTRACT  9-12
第1章文献综述  12-28
  1.1 基因芯片技术的产生与发展  12-17
    1.1.1 基因芯片概念及其种类  12-15
    1.1.2 基因芯片应用  15-16
    1.1.3 柑橘基因组芯片现状  16-17
  1.2 荧光定量PCR技术  17-19
    1.2.1 荧光定量PCR的原理及应用  17
    1.2.2 荧光定量PCR的分类  17-19
  1.3 全长cDNA克隆技术  19-20
    1.3.1 全长cDNA克隆的策略  19
    1.3.2 全长cDNA克隆的方法分类  19-20
  1.4 RNAI/PTGS原理及应用  20-23
    1.4.1 RNAi的发现  21
    1.4.2 RNAi/PTGS原理  21
    1.4.3 RNAi/PTGS的应用  21-23
  1.5 乙烯代谢  23-25
    1.5.1 乙烯的生物学作用  23
    1.5.2 乙烯代谢途径  23
    1.5.3 乙烯代谢途径相关基因的研究  23-25
  1.6 脱落研究  25-28
    1.6.1 低氧应答基因与脱落的关系  25
    1.6.2 伤害诱导基因与脱落的关系  25-26
    1.6.3 乙烯受体与脱落的关系  26-28
第2章绪论  28-30
  2.1 研究的目的与意义  28
  2.2 研究的主要内容  28-29
  2.3 技术路线  29-30
第3章材料与方法  30-44
  3.1 植物材料及处理  30
  3.2 大肠杆菌、农杆菌及载体  30-31
  3.3 常用试剂和培养基  31-32
  3.4 主要仪器  32
  3.5 实验方法  32-41
    3.5.1 柑橘果实离层总RNA提取方法  32-33
    3.5.2 芯片数据产生及分析  33-34
    3.5.3 RNA反转录及RealTime-PCR方法  34-35
    3.5.4 基因全长cDNA克隆  35-37
    3.5.5 利用RNAi/PTGS技术及超量表达技术构建重组质粒  37-41
  3.6 外植体材料的准备  41-44
    3.6.1 农杆菌侵染液的制备  41
    3.6.2 BASTA抗性筛选  41-42
    3.6.3 上胚轴的转化过程  42-44
第4章乙烯诱导果实脱落的柑橘基因组芯片分析  44-52
  引言  44
  4.1 材料与方法  44-45
  4.2 结果与分析  45-52
    4.2.1 RNA提取  45
    4.2.2 芯片杂交及差异表达基因筛选  45-46
    4.2.3 数据可靠性分析  46-50
    4.2.4 差异基因功能分析  50-52
第5章伏令夏橙果实离层CsHRP的克隆、表达和特征分析  52-60
  引言  52
  5.1 材料与方法  52-53
  5.2 结果与分析  53-60
    5.2.1 CsHRP的全长cDNA克隆与结构分析  53-55
    5.2.2 CsHRP生物信息学分析  55
    5.2.3 RealTime-PCR结果分析  55-56
    5.2.4 CsHRP的RNAi/PTGS载体构建  56-60
      5.2.4.1 CsHRP正、反向片段的克隆  56
      5.2.4.2 CsHRP RNAi干涉载体的构建  56-58
      5.2.4.3 CsHRP的超量表达载体构建  58-60
第6章伏令夏橙伤害诱导基因家族(CsWIP)的克隆和分析  60-76
  引言  60
  6.1 材料与方法  60-62
    6.1.1 材料处理和乙烯定量分析  60-61
    6.1.2 伤害诱导基因的克隆和表达研究所用引物设计  61-62
  6.2 结果与分析  62-76
    6.2.1 叶片萎蔫、脱落、及乙烯的产生过程  62-63
    6.2.2 CsWIP家族基因的克隆  63-64
    6.2.3 CsWIP基因家族核苷酸序列分析  64-66
    6.2.4 CsWIP家族蛋白分析  66-68
    6.2.5 CsWIP基因家族的诱导表达特征  68-70
    6.2.6 CsWIP1的RNAi/PTGS载体构建  70-72
    6.2.7 CsWIP1的超量表达载体构建  72-73
    6.2.8 植株转化抗性筛选结果  73-76
第7章伏令夏橙果实离层ETR2的克隆、表达和特征分析  76-84
  引言  76
  7.1 材料与方法  76-77
  7.2 结果分析  77-84
    7.2.1 ETR2的全长cDNA克隆  77-79
    7.2.2 ETR2蛋白质结构预测分析  79-82
    7.2.3 RealTime-PCR结果分析  82-84
第8章讨论与总结  84-88
  8.1 柑橘基因芯片讨论与结论  84
  8.2 对低氧应答基因(CsHRP)的讨论与结论  84-85
  8.3 对伤害诱导基因(CsWIPs)的讨论与结论  85-87
  8.4 对乙烯受体基因(ETR2)的讨论与结论  87-88
参考文献  88-100
致谢  100-102
参与课题与发表文章目录  102-104
附录Ⅰ 缩略词表  104

乙烯诱导伏令夏橙果实脱落过程中重要功能基因的克隆、表达与功能分析

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