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作物抗蚜虫转基因技术研究
作 者: 李晓明
导 师: 彭明;崔百明
学 校: 石河子大学
专 业: 生物化学与分子生物学
关键词: 棉蚜 RNAi dsRNA 拟南芥
分类号: S188
类 型: 硕士论文
年 份: 2010年
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内容摘要
棉蚜是导致世界上农作物产量严重下降的主要害虫之一。成若蚜群集于棉叶背面和嫩尖上,以针状口器刺吸汁液,由于组织的细胞受到破坏,致使棉叶正反面生长不平衡,叶片背面卷曲,形成卷叶,植株矮缩,受害棉苗叶发育受阻。而喷施化学杀虫剂严重污染环境,通过表达毒蛋白来抑制或杀死害虫可能使蚜虫产生抗性。所以寻找一种新型的抗虫策略既能够有效地抵抗蚜虫,又是安全的,就成为一种迫切的要求。RNA干扰是近期发现的一种新的基因调控机制,它利用RNA序列匹配,专一地识别靶基因,在转录水平、转录后水平或翻译水平抑制靶基因表达。在农业上RNAi技术已发展成为控制虫害、提高作物品质的新方法。与传统转基因手段相比,这一技术更具选择性和安全性。本研究拟尝试通过RNAi技术,降解靶基因mRNA,抑制棉蚜内源靶基因的表达,从而达到抑制棉蚜数量的目的。根据已知生物信息学数据,通过RT-PCR技术从棉蚜中克隆了API, Catb5, Catb6, RPL18基因,AP1为网格蛋白基因,Catb5、Catb6为组织蛋白酶基因家族的两个基因,RPL18为核糖体蛋白酶基因。这四种基因都为棉蚜的持家基因,由于Catb5、Catb6组织蛋白酶基因缺少3’端,分别对Catb5、Catb6做了3’RACE,将AP1,Catb5, Catb6, RPL18基因分别通过正向和反向插入到pBi35SG12质粒中,构建了pBi35SAP1, pBi35SC5, pBi35SC6, pBi35SR18四个RNAi载体,通过农杆菌介导的方法将四个基因导入拟南芥中,经过卡那霉素和PCR技术筛选出阳性转化子,得到转基因植株。将同等数量的棉蚜接种到转基因植株和对照植株上,经过15天的观察,发现C6和R18转基因拟南芥上的蚜虫数量逐渐减少,而AP1转基因拟南芥上的蚜虫数量与野生型拟南芥上的蚜虫数量先是增加后开始减少,所以初步推断C6、R18植株起到抗虫作用。
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全文目录
摘要 5-6 Abstract 6-7 目录 7-9 缩略词及英汉对照 9-10 引言 10-11 第一章 文献综述 11-19 1 棉蚜的发生 11-12 1.1 棉蚜的形态特征 11 1.2 棉蚜的为害特点 11-12 1.3 棉蚜的生活习性 12 2 抗蚜虫的方法 12-15 2.1 化学杀虫剂 12-13 2.2 抗虫基因 13-15 3 植物介导的RNA干扰技术 15-19 3.1 RNAi的发现 16 3.2 RNAi的机制 16-17 3.3 RNAi系统性扩散 17 3.4 RNAi在防治农作物害虫的应用 17-19 第二章 棉蚜基因的克隆 19-31 1 材料与试剂 19-20 1.1 棉蚜 19 1.2 菌种 19 1.3 常用酶和生化试剂 19 1.3.1 分子生物学常用酶及试剂盒 19 1.3.2 分子生物学常用生化试剂 19 1.4 植物材料 19 1.5 培养基 19 1.6 主要仪器设备 19-20 2 方法 20-23 2.1 棉蚜的鉴定 20 2.2 模式植物的选择 20 2.3 棉蚜RNA的提取及cDNA的合成 20 2.4 扩增棉蚜AP1,Cath5,Cath6,RpL18基因 20-21 2.5 PCR产物的回收 21 2.6 扩增产物的克隆 21-23 2.7 序列测定及比对 23 3 结果与分析 23-31 3.1 模式植物的选择 23-24 3.2 棉蚜的鉴定 24 3.3 目的基因的扩增 24-25 3.4 AP1基因序列分析及比对结果 25 3.5 Cath5基因序列分析及比对结果 25-27 3.6 Cath6基因序列分析及比对结果 27-29 3.7 RPL18基因序列分析及比对结果 29-31 第三章 RNAi干扰载体的构建 31-41 1 实验材料 31 1.1 菌株与质粒 31 1.2 主要试剂 31 1.3 主要仪器设备 31 2 方法 31-34 2.1 PCR引物的设计与合成 31 2.2 干扰载体pBi35SAP1的构建 31-32 2.3 干扰载体pBi35SC5的构建 32-33 2.4 干扰载体pBi35SC6的构建 33-34 2.5 干扰载体pBi35SR18的构建 34 3 结果与分析 34-41 3.1 干扰载体pBi35SAP1的构建及转化农杆菌GV3101 34-36 3.2 干扰载体pBi35SC5的构建及转化农杆菌GV3101 36-37 3.3 干扰载体pBi35SC6的构建及转化农杆菌GV3101 37-39 3.4 干扰载体pBi35SRi8的构建及转化农杆菌GV3101 39-41 第四章 遗传转化研究 41-45 1. 实验材料 41 1.1. 植物材料 41 1.2 主要试剂 41 2 农杆菌介导的拟南芥遗传转化 41 2.1 拟南芥播种及管理 41 2.2 农杆菌侵染液的制备 41 2.3 Floral Dip法转化拟南芥 41 3 转基因拟南芥植株筛选与检测 41-42 3.1 抗性筛选 41 3.2 抗性植株的PCR检测 41-42 4 转基因植株的抗虫试验 42 5 结果与分析 42-45 5.1 转基因植株的筛选和检测 42-44 5.2 转基因植株的抗虫试验结果 44-45 第五章 结论和讨论 45-47 参考文献 47-52 附录1: 基因序列 52-53 附录2: 主要试剂配制 53-54 附录3: 载体构建流程图 54-55 致谢 55-56 简历 56-57 导师评阅表 57
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中图分类: > 农业科学 > 农业基础科学 > 农业生物学 > 农业生物工程
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