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组蛋白乙酰化对骨髓间充质干细胞向平滑肌细胞分化的调控作用及机制

作　者: 杨婧
导　师: 梁志清
学　校: 第三军医大学
专　业: 妇产科学
关键词: 组蛋白修饰乙酰化细胞分化骨髓间充质干细胞膀胱平滑肌细胞丁酸钠
分类号: R329
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

括约肌功能障碍(ISD)是压力性尿失禁(SUI)的主要原因,现有的治疗方法包括手术治疗和非手术治疗,但这些方法仅改变了盆底解剖结构,均不能纠正ISD,不能从本质上恢复患者的括约肌功能。鉴于近年来运用于细胞移植修复肌肉损伤、改善肌肉收缩功能的报道,人们对干细胞移植治疗SUI寄予厚望。然而至今为止该疗法并没有获得预期的疗效,究其原因是由于干细胞移植后既往的研究仅关注了移植后细胞表型的变化,对其在体内外分化的机制研究甚少,导致人们不能很好的运用其分化的能力达到治疗疾病的目的,因此研究干细胞在体内外微环境诱导下的适应性变化及机制显得十分重要。近年来,组蛋白修饰对干细胞分化的影响引起了人们的关注,组蛋白修饰是指不改变细胞DNA序列,通过组蛋白亚基发生乙酰化、甲基化等共价修饰,这些修饰可为基因的表达提供一种识别的标志,为其他蛋白与DNA的结合产生协同或拮抗效应,它是一种动态转录调控成分,称为组蛋白密码。这些密码可被特定蛋白质识别,将其翻译成特定的染色质状态以实现对特定基因的调节,其中,与特异性基因转录调控关系最为密切的是组蛋白乙酰化修饰,研究表明,组蛋白H3亚基上赖氨酸残基的乙酰化在染色质包装和基因转录调控中扮演着重要的角色。一般而言,组蛋白H3K9乙酰化与基因的活化有着密切的关系,相反的,H3K9去乙酰化与基因的沉默相关。一旦有乙酰化的存在,DNA的构型发生松解,转录因子得以与核小体中相应的顺式作用原件结合,同时募集相应反式作用因子,启动基因转录。那些组蛋白乙酰化程度密集的区域,其下游的DNA呈现出非常活跃的转录状态。然而目前尚不了解干细胞进入特定的微环境以后,是否也通过其特定基因的组蛋白修饰,实现其在该环境下重新编程并产生与环境细胞相类似的适应性。骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells, BMSCs)是一小群存在于骨髓中的非造血细胞,它具有增殖和多向分化潜能。BMSCs具有取材方便、扩增迅速、可自体移植等特点,因此,将其作为种子细胞用于细胞治疗已成为当前研究的热点。本实验取材于雌性SD大鼠,分别利用密度梯度离心法和胶原酶消化法,分离培养了BMSCs和BSMCs;并模拟盆底环境,运用接触共培养方法建立诱导BMSCs向膀胱平滑肌分化的体外模型,旨在研究BMSCs体外分化为平滑肌过程中,平滑肌相关基因启动子区组蛋白乙酰化水平是否发生改变,组蛋白乙酰化水平的改变对BMSCs向BSMCs分化的影响。主要实验方法及结果如下：一、细胞培养鉴定及共培养模型的建立1.大鼠BMSCs的分离与培养无菌操作下取下一月龄雌性SD大鼠双侧股骨、胫骨,反复冲洗骨髓腔,混匀冲洗液,离心弃上清后precoll提取所需单核细胞层,加入含10%FBS的DMEM-F12培养液中,置37℃的5%CO2培养箱中培养。所得贴壁细胞,流式细胞仪检测其分子表型。结果：成功分离出形态为梭形的骨髓单核细胞,其分子表型为：CD31、CD45阴性、CD29、CD44、CD166阳性。2.大鼠BSMCs的分离与培养无菌条件下取一月龄雌性SD大鼠膀胱,采用胶原酶消化法分离单个核细胞,含10%FBS的HG-DMEM培养,获得贴壁细胞,免疫荧光法鉴定其标志蛋白的表达。结果：平滑肌特异性的a-SMA, Calponin和SM-MHC表达阳性。3.建立大鼠BSMCs诱导BMSCs分化的体外共培养模型以悬挂式细胞培养小室transwell底层的多孔膜(1um)作为BMSCs和BSMCs之间的间隔,将BMSCs和BSMCs分别接种于多孔膜两侧作为实验组,未经过接触共培养的同批次BMSCs作为对照组。取下接触共培养3日后BMSCs, RT-PCR检测其与对照组成肌分化平滑肌标志性蛋白。结果：RT-PCR显示接触共培养组较对照组的BMSCs中平滑肌标志性蛋白的表达量明显增加,提示BMSCs在接触共培养体系中成肌分化,建模成功。二、组蛋白乙酰化对BMSCs向BSMCs分化的影响1. ChIP、qPCR分析平滑肌标志性基因启动子区组蛋白乙酰化水平对BMSCs向平滑肌分化的影响实验采用ChIP技术,在活细胞状态下甲醛固定共培养前后BMSCs中蛋白质-DNA复合物,超声打断染色质片段,调整片段大小在200-1000bp,然后通过抗组蛋白特定乙酰化位点H3K9抗体沉淀分化前后BMSCs基因组,定量PCR扩增BMSCs中平滑肌标志性基因启动子区DNA片段,了解干细胞分化前后启动子区域乙酰化程度的变化情况,从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。结果：共培养诱导分化后,BMSCs平滑肌标志性基因启动子区乙酰化程度较未分化前明显增加,启动子区域DNA的乙酰化促进了BMSCs向BSMCs分化。2、组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDACi)丁酸钠对BMSCs分化的影响将二代BSMCs种植于悬挂式细胞培养小室transwell下室面,培养箱中培养6 h后翻转transwell将其放回含平滑肌培养液的六孔板中继续培养。次日将BMSCs种植于膜内面。分组标记,实验组上室内加入含3.0 mmol/L丁酸钠的BMSCs培养液,对照组加入普通BMSCs培养液,分别取下培养1、2、3天BMSCs,细胞免疫荧光、qPCR分析不同时间段BMSCs向BSMCs分化的情况。结果：HDACi丁酸钠可以增强骨髓间充质干细胞向平滑肌的分化能力,提高组蛋白乙酰化程度可以促进BMSCs分化。结论：本研究成功分离出BMSCs及BSMCs,并模拟体内环境建立了诱导分化模型,在该模型的基础上研究组蛋白乙酰化对BMSCs分化能力的影响。研究表明,干细胞分化后目的基因启动子区域存在乙酰化程度的明显提高；增加间充质干细胞分化环境中的乙酰化程度也能大大提高干细胞分化的能力。本研究深入探索组蛋白修饰在骨髓间充质干细胞分化过程中的调控机制,为BMSCs移植治疗压力性尿失禁的研究奠定基础。

全文目录

英文缩写一览表  4-6
英文摘要  6-10
中文摘要  10-13
前言  13-15
第一部分骨髓间充质干细胞和膀胱平滑肌细胞分离培养及鉴定  15-34
  实验一骨髓间充质干细胞的分离培养及鉴定  15-19
    材料与方法  15-18
    结果  18-19
  实验二膀胱平滑肌细胞的培养及鉴定  19-24
    材料与方法  19-22
    结果  22-24
  实验三 BMSCs向BSMCs分化的体外共培养模型的建立  24-31
    材料与方法  24-30
    结果  30-31
  讨论  31-34
第二部分组蛋白乙酰化对BMSCs向BSMCs分化的影响  34-52
  实验一平滑肌标志性基因启动子区组蛋白乙酰化水平对BMSCs向平滑肌分化的影响  34-42
    材料与方法  34-42
  实验二组蛋白去乙酰化酶抑制剂丁酸钠对BMSCs分化的影响  42-43
    材料与方法  42-43
  结果  43-48
  讨论  48-52
全文总结  52-53
致谢  53-54
参考文献  54-58
文献综述  58-64
  参考文献  62-64
攻读硕士期间发表的论文  64

组蛋白乙酰化对骨髓间充质干细胞向平滑肌细胞分化的调控作用及机制

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