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两组新型的靶向性基因治疗艾滋病的药物研究

作　者: 申景平
导　师: 卢圣栋
学　校: 中国协和医科大学
专　业: 生物化学及分子生物学
关键词: 趋化因子受体医科大学重组体融合蛋白博士学位论文中和作用艾滋病复合物协和毒素蛋白
分类号: R978.7
类　型: 博士论文
年　份: 2002年
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内容摘要

HIV是艾滋病的根本原因。它在艾滋病人体内以两种方式存在：存在于被感染的CD4+细胞中，以游离形式存在于血液循环中。清除这两种HIV的存在方式，艾滋病将从根本上被治愈。历史上，曾有过CD₄-PE40（绿脓杆菌毒素Ⅱ-Ⅲ区段）的基因工程设计，试图达到上述目的，但鉴于大肠杆菌表达的CD4蛋白及作为人体异源蛋白的PE40具有强烈的免疫原性而归于失败。鉴于这样的负面经验，本课题试图将对细胞有强烈杀伤作用的PEIIImut（绿脓毒素第三区段的突变基因片段）以表达型重组体的形式靶向导入受HIV感染的细胞，致使PEIIImut仅在该细胞中表达，从而杀灭该细胞。这一设计，既避免了毒素蛋白的免疫原性，也避免了对任何其他类型细胞的杀伤作用。为实现上述目的，我们设计了以基因工程的技术方法在体外获得两个系列各三种的融合蛋白：其一个部分，将由来自人体的编码富含阳性氨基酸的多肽的基因片段表达获得；其另一部分，将由可与唯有受HIV感染的细胞表面才有的HIV的gp120糖蛋白相结合的、来自CD4+细胞表面的编码HIV受体相关蛋白片段的基因片段表达获得。该融合蛋白的第一部分将结合PEIIImut表达型DNA重组体；该融合蛋白的第二部分（如CD4、CXCR4、CCR5的部分片段）将携带整个DNA-蛋白质复合物与受HIV感染的细胞表面的gp120结合，进而使整个复合物进入该细胞，且表达出PEIIImut蛋白，从而杀灭受HIV感染的细胞。与此同时，融合蛋白的第二部分还将结合在血循环中存在的游离的HIV病毒，使之因中和而失去感染力。本课题设计并实施了两个系列的这类设计的方案。鉴于HIV与SIV（猴免疫缺陷病毒）在生物学功能上有平行关系，细胞活性试验是以SIV为对象进行的。本研究共分两部分。以被HIV／SIV感染的细胞表面表达gp120／gp41作为靶向性基因治疗的靶点，通过基因工程技术，体外构建一系列可以分别表达CXCR4或CCR5或CD4与组蛋白H1片段（86个氨基酸，富含阳性氨基酸）重组体，将重组体导入一种毕赤酵母（KM71）细胞中表达一组融合蛋白，通过SDS-PAGE，切胶纯化目的蛋白。将纯化所得的目的蛋白与可以表达突变强毒的绿脓杆菌毒素第三功能结构域的重组体（pA-PEⅢmut）在体外进行结合，形成DNA-蛋白质复合物（DNA-Protein complex），即CD4V1V2-H1-pAPEⅢmut、CXCR4-H1-pAPEⅢmut、CCR5-H1-pAPEⅢmut。用上述复合物处理被SIV感染的CEMX-174细胞，观察上述不同剂量的（2、4、6μg，以DNA计）复合物在单独或联合（如CD4V1V2-H1-pAPEⅢmut／CXCR4-H1-pAPEⅢmut、CD4V1V2-H1-pAPEⅢmut／CCR5-H1-pAPEⅢmut）应用时对被感染的CEMX-174细胞的杀伤作用，对照组为不加任何处理因素的被SIV感染的CEMX-174细胞。同时还观察了上述复合物在单独和联合使用时对SIV感染正常细胞时的中和作用，对照组为SIV加正常的CEMX-174细胞。结果显示：（1）杀伤试验：以DNA计，所使用2、4、6μg三个剂量组的复合物及其复合物的组合，对被感染细胞的杀伤率分别如下：CD4V1V2-H1₈₆／pA-PEⅢ_mut的杀伤率分别为46.2％、52.2％、62.2％；CCR5-H1-24／pA-PEⅢ_mut的杀伤率分别为33.1％、41.2％、48.3％；CXCR4-H1-86／pA-PEⅢ_mut的杀伤率分别为：42.8％、51.2％、63.5％；CD4V1V2-H1₈₆／CCR5-H1-24／pA-PEⅢ_mut联用组的杀伤率分别为47.2％、50.7％和61.9％；CD4V1V2-H1₈₆／CXCR4-H1／pA-PEⅢ_mut联用组的杀伤率分别为52.2％、60.4％和71.9％，并有剂量依赖关系。CXCR4-H1-PEⅢ三个剂量（2、4、6ug）处理组的病毒滴度分别为640、320、320；CD4V1V2-H1／pA-PEⅢ_mut的三个剂量组的病毒滴度分别为640、640、320；CCR5-H1-24／pA-PEⅢ_mut组分别为1280、640、640；2、4、6μg DNA剂量的CD4V1V2-H1／CXCR4-H1／pA-PEⅢ_mut对SIV的中和作用为320、320、160；CD4V1V2-H1／CCR5-H1-／pA-PEⅢ_mut的三个剂量组（2、4、6μg）的滴度分别为640、320、320。而对照组的滴毒大于5120，显著的地大于上述各实验组。各实验组中的存活细胞数与对照组相比显著减少（p＜0.05）。同时还发现各实验组的荧光细胞数也显著减少（p＜0.05）。（2）中和试验：2、4、6μg DNA剂量的复合物对SIV的中和作用分别为：CD4V1V2-H1／pA-PEⅢmut 52％、55.5％、62％；CXCR4-H1／pA-PEⅢmut分别为48.3％、55.1％、59.2％；CCR5-H1／pA-PEⅢmut对SIV的中和作用分别为44.2％、51.1％、53.6％；CD4V1V2-H1／CXCR4-H1／pA-PEⅢmut对SIV的中和作用分别为57.9％、62.6％、71.7％；CD4V1V2-H1／CCR5-H1／pA-PEⅢmut对SIV的中和作用分别为52.3％、57.0％、62.3％。同时还显示，各实验组的荧光细胞数也显著减少（p＜0.05）。各处理组的病毒滴度结果显示：CXCR4-H1／pA-PEⅢmut三个剂量（2、4、6ug）处理组的病毒滴度分别为640、640、320；CD4V1V2-H1／pA-PEⅢmut的三个剂量组的病毒滴度分别为640、640、320；CCR5-H1-24／pA-PEⅢmut组分别为1280、640、640；2、4、6μg DNA剂量的CD4V1V2-H1／CXCR4-H1／pA-PEⅢmut对SIV的中和作用为640、320、160；CD4V1V2-H1／CCR5-H1／pA-PEⅢmut的三个剂量组（2、4、6μg）的滴度分别为640、640、320。而对照组的滴毒大于5120，显著的大于上述各试验组。第二部分：S型靶向性基因治疗的研究根据现有的文献报道，我们对上述融合蛋白的组成进行了改进。虽然CD4、CXCR4、CCR5有多个功能结构域，但是并不都与结合功能有关。所以我们根据文献报道分别截取其中参与与gp120／gp41结合的结构域，即CD4的V1区（100个氨基酸）、CXCR4的第二个胞外环区（XE，27个氨基酸）、CCR5的N末端（RN，30个氨基酸）用以取代各相应的靶向部分。同时，我们还从GenBank中钓取编码一种人DNA结合蛋白（SON）的序列，选取其中一段编码72个氨基酸的DNA序列，该序列富含阳性氨基酸，用以取代融合蛋白中的H1，与前述的靶向部分组成一组新型的可以编码融合蛋白的基因，即CD4V1SON、XESON、RNSON。为了提高融合蛋白的表达水平，通过PCR搭桥技术和基因重新合成技术，将编码目的基因中大肠杆菌不嗜好的密码子突变成大肠杆菌嗜好的密码子。通过基因重组技术，将上述目的基因克隆到一种温度控制型表达载体，获得一组表达型重组体。通过温度诱导，大量制备目的蛋白。通过SDS-PAGE，切胶回收、纯化目的蛋白。通过凝胶成像扫描系统分析，结果显示三种重组体的表达量分别占整个菌体蛋白的25％、21％和14％。将纯化所得的目的蛋白与可以表达突变的强毒绿脓杆菌毒素第三功能结构域的重组体（pA-PEⅢmut）在体外进行结合，形成DNA-蛋白质复合物（DNA-Protein complex），即CD4V1SON-pA-PEⅢmut、XESON-pA-PEⅢmut、RNSON-pA-PEⅢmut。用上述复合物处理被SIV感染的CEMX-174细胞，观察上述不同剂量的（2、4、6μg，以DNA计）复合物在单独或联合（如CD4V1-pA-PEⅢmut／XESON-pA-PEⅢmut、CD4V1SON-pA-PEⅢmut／RNSON-pA-PEⅢmut）应用时对被感染的CEMX-174细胞的杀伤作用，对照组为不加任何处理因素的被SIV感染的CEMX-174细胞。同时还观察了上述复合物在单独和联合使用时对SIV感染正常细胞时的中和作用，对照组为SIV加正常的CEMX-174细胞。结果显示：（1）杀伤试验：2、4、6μg DNA剂量的复合物单独和联合使用时，对SIV感染的CEMX-174细胞的杀伤率分别为：CD4V1-SON／pA-PEⅢ_mut的杀伤率分别为43％、47.5％、59.1％；RN-SON／pA-PEⅢ_mut的杀伤率分别为35.7％、42.8％、47.2％；XE-SON／pA-PEⅢ_mut的杀伤率分别为：39.4％、43.8％、53.3％；CD4V1-SON／RN-SON／pA-PEⅢ_mut的杀伤率分别为38.3％、43.8％和57.2％。CD4V1-SON／XE-SON／pA-PEⅢ_mut的杀伤率分别为43.8％、50.9％和60.9％，并有剂量依赖关系。CD4V1-SON／pA-PEⅢ_mut三个剂量（2、4、6ug）处理组的病毒滴度分别为640、640、320；XE-SON／pA-PEⅢ_mut的三个剂量组的病毒滴度分别为640、320、320；RN-SON／pA-PEⅢ_mut组分别为1280、640、320；2、4、6μg DNA剂量的CD4V1-SON／XE-SON／pA-PEⅢmut对SIV的中和作用为640、320、160；CD4V1-SON／RN-SON／pA-PEⅢmut的三个剂量组（2、4、6μg）的滴度分别为640、640、320，显著低于对照组。各实验组中的存活细胞数与对照组相比也显著减少（p＜0.05）。同时还发现各实验组的荧光细胞数也显著减少。（2）中和试验：2、4、6μg DNA剂量的复合物对SIV的中和作用分别为：CD4V1-SON-PEⅢ的中和作用分别为47.4％、55.5％、59.8％；XE-SON-PEⅢ的中和作用分别为45.8％、48.3％、57.0％；RN-SON／pA-PEⅢmut分别为45.8％、50.8％、57.3％；CD4V1-SON／XE-SON／pA-PEⅢmut的中和作用分别为52.0％、57.6％、61.7％；CD4V1-SON／RN-SON／pA-PEⅢmut的中和作用分别为44.5％、51.7％、57.3％。同时还显示，各实验组的荧光细胞数也显著减少（p＜0.05）。CD4V1-SON／pA-PEⅢmut三个剂量（2、4、6ug）处理组的病毒滴度分别为640、320、160；XE-SON-PA-PEⅢmut的三个剂量组的病毒滴度分别为640、640、320；RN-SON／pA-PEⅢmut组分别为1280、640、320；2、4、6μg DNA剂量的CD4V1-SON／XE-SON／pA-PEⅢmut对SIV的中和作用为640、320、160；CD4V1-SON／RN-SON／pA-PEⅢmut的三个剂量组（2、4、6μg）的滴度分别为640、320、320。分别显著低于对照组的5120。细胞试验表明，本研究所设计的具有靶向性的融合蛋白可以有效地将毒素编码蛋白的基因的重组体(pA-PEⅢ_mut)导入被SIV感染的细胞中，并能表达出突变型毒素蛋白PEⅢ_mut该毒素可以有效地杀伤被SIV感染的细胞。同时，本研究的数据还显示，靶向融合蛋白（显然，起作用的是CD4或CCR5或CXCR4的部分蛋白片段）可以有效地中和游离状态的SIV，使被中和的病毒失去感染能力。本研究为抗HIV／SIV提供了一种新途径。根据该技术路线，对编码靶向蛋白的基因加以变换，类似的方案还可以用于癌症、自身免疫性疾病等的治疗。

全文目录

摘要  3-8
Abstract  8-12
前言  12-18
材料与方法  18-128
  实验材料  18-26
  实验方法  26-41
    第一部分常用实验方法  26-36
    第二部分常用实验方法  36-41
  实验结果  41-43
  实验流程  43-85
  讨论  85-93
  实验结果  93-122
  讨论  122-124
  小结  124-128
参考文献  128-146
趋化因子及其受体与艾滋病  146-161
致谢  161

两组新型的靶向性基因治疗艾滋病的药物研究

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